最近有小伙伴咨询我孟德尔随机化能不能加到基础实验研究中，当然是可以的啦！
怎么用呢？
今天就给大家带来一篇相关的设计思路。
文章是来说华中科技大学同济医院团队，这是一项单基因研究，团队首次研究了ADAMTS16在肺腺癌中的作用及其潜在机制。文章首先通过孟德尔随机化和转录组数据证实了ADAMTS16在LUAD中表达上调，并与上皮-间质转化（EMT）相关，接下来通过体内外实验验证以上发现，用到的实验方法（例如IHC，WB，qPCR，ChIP等）都是我们实验中经常见到的，这篇文章干湿结合的思路值得好好研究一下。
想通过干湿结合设计课题的宝子可以联系我，没时间做实验的临床科研人员也可以考虑单纯通过孟德尔或者公共数据库发文，我这里也能提供相关的生信分析，欢迎来询~
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题目：在肺腺癌中，ADAMTS16通过TGF-β1激活的反馈回路驱动上皮-间质转化和转移
发表时间：2024.11
肺腺癌（LUAD）是肺癌的主要亚型。LUAD患者预后不良的主要原因是转移。ADAMTS16是ADAMTS家族的重要成员，参与肿瘤进展。然而，其在LUAD中的作用和调控机制尚不清楚。
基于生物信息学分析结果和前期研究，作者假设ADAMTS16是LUAD中EMT和转移的关键调控因子。研究旨在通过临床样本和体内外实验的综合分析，评估ADAMTS16在LUAD中的表达，确定其预后意义，并探讨其在EMT和转移中的作用。
研究思路
研究结果
ADAMTS16在LUAD中表达上调，并与不良预后相关
为了研究ADAMTSs蛋白表达与肺癌之间的因果关系，进行了蛋白质组范围内的两样本MR分析。收集了最近的大规模血浆蛋白质组研究，两项大型肺癌GWAS分别纳入23,848例，16,605例对照和11,348例，15,861例对照。使用这些具有高度相关snp的蛋白质作为暴露，并将肺癌风险作为结果进行MR分析。通过Wald比值或IVW方法进行的MR分析揭示了ADAMTS1或AMAMTS16与肺癌风险之间的因果关系。较高水平的ADAMTS1和ADAMTS16被遗传学预测与肺癌相关。
然后，在多个LUAD队列中探索了ADAMTS1和ADAMTS16的表达谱。尽管在多个数据集中，ADAMTS1和ADAMTS16在LUAD和邻近肺组织中均存在差异表达，但在TCGA队列中，只有ADAMTS16与总生存率相关。因此，ADAMTS16可能在LUAD肿瘤发展中发挥关键作用。
高血浆ADAMTS16水平与淋巴结和远处转移相关。临床标本证实了LUAD中ADAMTS16的上调。组织微阵列中LUAD组织的IHC评分高于正常肺组织。组织微阵列队列的Kaplan-Meier生存分析显示，ADAMTS16免疫染色阴性的患者比ADAMTS16免疫染色阳性的患者生存时间更长。组织微阵列数据的单因素和多因素Cox回归分析显示，ADAMTS16的表达预示LUAD患者预后不良。
ADAMTS16促进LUAD细胞的EMT和迁移
为了阐明ADAMTS16在LUAD中的潜在机制，在TCGA-LUAD队列中进行了GSEA，结果显示ADAMTS16与EMT之间存在正相关。PCR、WB和IF分析显示，ADAMTS16被敲低后，ZO-1和E-cadherin的表达增加，vimentin的表达减少，表明ADAMTS16抑制抑制了LUAD细胞中的EMT。此外，伤口愈合和transwell实验显示，沉默ADAMTS16阻碍了A549和H1975细胞的迁移和侵袭潜力。这些发现表明ADAMTS16是EMT的驱动基因。
为了进一步评估ADAMTS16对LUAD转移的影响，裸鼠尾静脉注射稳定敲除ADAMTS16或控制A549细胞的A549细胞。裸鼠在尾静脉注射后6周处死，以评估肺和胸壁的转移灶。ADAMTS16敲低显著减少肺转移结节。ADAMTS16敲低组肺重量和荧光素酶活性降低。与对照组相比，有3只小鼠发生胸壁转移，而敲低ADAMTS16的小鼠没有发生胸壁转移。肿瘤组织免疫组化染色进一步证实了ADAMTS16敲低组对ADAMTS16的抑制作用。
ADAMTS16通过促进TGF-β1的激活来促进EMT
TCGA-LUAD的GSEA数据显示，ADAMTS16与TGF-β信号通路呈正相关。然而，ADAMTS16过表达对LAP-TGF-β1没有影响，但增加了成熟的TGF-β1，激活了Smad2/3。LUAD细胞的免疫荧光显示，ADAMTS16在ECM中与TGF-β1共定位。Co-IP揭示了ADAMTS16与LAP-TGF-β1之间的相互作用。沉默ADAMTS16降低成熟TGF-β1，灭活Smad2/3。过表达ADAMTS16增加了A549和H1975细胞上清液中活性TGF-β1，但未增加TGF-β1总量。
ELISA结果显示，LUAD患者血浆ADAMTS16与TGF-β1活性及TGF-β1活性百分比呈正相关，但与TGF-β1总量无关。TGF-β信号通路是EMT的主要诱导剂。沉默ADAMTS16会抑制EMT，而重组TGF-β1蛋白则会减弱ADAMTS16敲低对EMT的抑制作用。重组TGF-β1蛋白处理也恢复了ADAMTS16敲低导致的LUAD细胞迁移和侵袭能力受损。因此，ADAMTS16通过TGF-β信号通路诱导EMT。
SOX4激活ADAMTS16的转录
SOX4操纵一组基因的表达来驱动肿瘤的发生和转移。通过JASPAR网站获得了ADAMTS16启动子区域中最有可能与SOX4结合的序列。ChIP-qPCR结果显示，SOX4在A位点和B位点被占用，在A位点的结合率更高。双荧光素酶报告基因实验结果表明，过表达SOX4可提高含有ADAMTS16启动子野生型位点A的报告基因质粒的转录活性，而SOX4的作用被A位点突变所消除。然而，位点B的转录活性不受SOX4过表达的影响。这些发现共同支持SOX4促进ADAMTS16转录的结论。
TGF-β通过SOX4调控ADAMTS16的表达
作者发现TGF-β1以剂量依赖的方式促进SOX4的表达。接下来，探讨TGF-β1如何调控SOX4的表达。Smad3是TGF-β信号通路的关键转录因子。ChIP-qPCR结果显示Smad3占据了SOX4的启动子。此外，Smad3的抑制剂SIS3抑制SOX4的表达。这些结果表明，TGF-β1通过转录因子SMAD3调控SOX4的表达。SOX4的抑制抑制了ADAMTS16的表达。TGF-β1也以剂量依赖的方式增加ADAMTS16的表达。TGF-β1促进SOX4与ADAMTS16启动子的结合。TGFBR1抑制剂SB431542抑制EMT和ADAMTS16的表达，并通过SOX4过表达拯救ADAMTS16。双荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR显示，SB431542降低了ADAMTS16的转录活性，但SOX4过表达抵消了这种抑制作用。动物模型显示，SB431542抑制TGF-β信号通路可降低肺转移和ADAMTS16的表达，而过表达SOX4可促进肺转移和ADAMTS16的表达。SOX4过表达消除了SB431542对肺转移的抑制作用。这些发现共同支持TGF-β1通过SOX4调控ADAMTS16的表达，ADAMTS16与TGF-β/SOX4轴形成正反馈回路，驱动EMT和转移。
文章小结
本研究阐明了ADAMTS16在LUAD患者预后和转移中的作用，还揭示了ADAMTS16/TGF-β/SOX4正反馈回路在LUAD中驱动EMT和转移。破坏ADAMTS16和TGF-β之间的反馈回路可能是预防LUAD转移的一种有希望的治疗方法。
这篇文章干湿结合用的非常成功，不仅仅是我们经常见到的通过TCGA或者GEO数据库来筛选关键基因，还用上了当前比较火的孟德尔随机化，这“时髦”赶得非常妙，虽然用到的实验都是一些常见的方法，但是最后发了8+，性价比非常高。也想考虑这种干湿结合思路的小伙伴可以联系我，孟德尔随机化对我来说也是小菜一碟哦~
