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自测序的单细胞研究往往有样本量较少的情况。为了避免审稿人diss，可以怎样做呢？
其实不仅是审稿人diss与否的问题，保证统计推断的可信度是严谨性中的一环。有些审稿人指出的问题，属于“凑字数”或可以协商调整，打交道时记得分清楚轻重缓急。
在单细胞研究中可以考虑加入误差线，如本文献Fig 6B，防止均值掩盖异质性，落入均值陷阱。更多应对方法，以及“方法的方法学”，就来找雪球私聊了解吧。
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文献解读全文
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Metabolic Heterogeneity and Potential Immunotherapeutic Responses Revealed by Single-Cell Transcriptomics of Breast Cancer
乳腺癌单细胞转录组学揭示的代谢异质性和潜在的免疫治疗反应
期刊：Apoptosis
IF：6.1
发布时间：2024/04/05
技术路线
细胞类型鉴定：
通过tSNE和UMAP降维聚类，将细胞分为不同的细胞类型，例如B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等。
肿瘤细胞异质性分析：
分析肿瘤细胞的拷贝数变异和克隆进化树，揭示肿瘤细胞的高度异质性和不同的进化轨迹。
代谢异质性分析：
分析不同细胞群中代谢通路和关键酶的表达，发现乳腺癌细胞在糖酵解、糖异生和脂肪酸合成等方面存在代谢异质性。
化疗敏感性预测：
利用pRRophetic算法预测不同细胞群对不同化疗药物的敏感性，发现代谢异质性可能导致化疗耐药性。
细胞间相互作用分析：
利用CellPhoneDB2分析细胞间相互作用，发现成纤维细胞和巨噬细胞与其他细胞类型存在广泛的相互作用。
成纤维细胞亚群分析：
将成纤维细胞分为不同的亚群，并分析其功能和分泌的细胞因子，发现不同亚群的成纤维细胞在肿瘤进展和治疗反应中可能发挥不同的作用。
T细胞异质性分析：
分析T细胞的亚群和功能，发现TNBC中存在大量耗竭型T细胞，并可能从免疫治疗中获益。
免疫组化和免疫荧光验证：
验证单细胞测序结果。
实验结果
Fig 1 BC的单细胞图谱
将tSNE应用于所有细胞中可变表达的基因，确定了B 细胞、基底细胞、树突状细胞、成纤维细胞、管腔上皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK 细胞、浆细胞和 T 细胞共10个簇（Fig 1B），并使用UMAP进一步将细胞分为52个簇（Fig 1D）。病灶和正常组织之间细胞簇的比例差异显著，表明病灶样本和正常组织样本之间存在瘤间异质性以及相似性（Fig 1E）。
Fig 2 BC细胞中的异质性和进化趋异
GO/KEGG结果表示，最高表达基因富集于细胞周期、突触囊泡周期、胞质 DNA 感应途径和化学致癌 DNA 加合物。这些功能可能表明肿瘤发生和进展。
轨迹分析结果表明，前分支的两种分化命运fate1、fate2的高表达水平基因分别提示癌细胞增殖、不良预后、肿瘤发生和进展（fate1）和对某些治疗的耐药性（fate2）。
Fig 3 BC恶性上皮细胞代谢异质性和化疗敏感性预测
专注于BC细胞，重新进行tSNE分析确定14个主要簇。标记基因的差异表达导致第4-6簇预后不同，而在其他簇中没有出现此类情况。这三个簇显示癌症抑制基因的高表达，并且与更好的结果相关。
接下来就是聚焦于代谢异质性的但细胞水平研究。首先，进行单细胞代谢富集，发现代谢途径在每个簇中的激活方式不同（Fig 3B）；然后通过热图展示TCA 循环中平均代谢基因表达、糖酵解和糖异生以及脂肪酸生物合成的簇间差异，说明BC在不同簇中表现出代谢异质性（Fig 3C）。TCA 循环、糖酵解和糖异生、脂肪酸生物合成与癌症进展甚至化疗耐药性密切相关。
先前的研究报道代谢重编程与化疗耐药性密切相关。
Fig 2也显示肿瘤细胞发育后可能与治疗耐药相关，
接下来就是把
代谢异质性 - 对化疗的反应
二者联系起来了。
研究团队通过两名临床特征不同的BC患者的治疗反应进行初步临床验证。参与TCA 循环、糖酵解、糖异生和脂肪酸生物合成的关键酶高表达的患者治疗反应不佳；三种关键酶表达较低甚至无表达的患者取得了良好的临床缓解。为了有力地验证发现，未来还需使用临床队列。
Fig 4 BC肿瘤微环境（TME）中的细胞-细胞互作
成纤维细胞和巨噬细胞表现出与其他细胞类型广泛的相互作用（Fig 4A）。各种细胞亚型（包括CAFs）之间的相互作用强度结果说明，CAFs表现出特别强的相互作用，与先前的报道一致（Fig 4B）。趋化因子家族，特别是某些CXCL趋化因子，在研究过程中发挥重要作用（Fig 4D），成纤维细胞作为信号发送者，中性粒细胞作为接收者。DC 和巨噬细胞作为介质发挥作用，并最终影响其他细胞簇（Fig 4F）。另外，Fig 4G表明MHC-I、MHC-II信号通路网络的情况。总体而言，细胞的相互作用强于预期，尤其是成纤维细胞和巨噬细胞。
Fig 5 肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）的详细特征
第0簇被表征未主要基于CXCL14过表达的CAFs，padj.<0.05（Fig 5A），对TCGA BC队列进行分析，进一步阐明CXCL14在BC中表达的临床意义（Fig 5B），亚型分布的差异暗示了表达 CXCL14 的成纤维细胞在 BC 进展和结果中的潜在不同作用或影响。
CXCL14 表达水平高的患者比 CXCL14 表达水平低的患者总生存期更好（Fig 5F），CAF-CXCL14可能不会加剧肿瘤进展。假设 CXCL14 的差异效应与成纤维细胞异质性相结合，可能会影响管腔 B 亚型患者的肿瘤行为和预后。然而，需要进一步的研究来确定所涉及的具体机制和这些发现的意义。
Fig 6 评估TNBC中肿瘤浸润性T细胞的功能状态
在 TNBC 中发现了大量耗竭的 T 细胞（簇 5、7 和 9），表明该特征是潜在的免疫检查点抑制剂靶点（Fig 6C）。发现 TNBC 高度表达 HAVCR2、CTLA4、LAG3 和 PDCD1，它们是免疫检查点抑制剂（如 atezolizumab、pembrolizumab 和 camrelizumab）的靶标（Fig 6F）。
从细胞异质性聚焦到代谢异质性，再将其与患者的预后反应联系起来，是基础和临床兼顾、成本效益与研究质量齐飞的优质思路。研究者既可凭借对影响机理的深入挖掘，轻松获得足够的创新性，也可结合大规模临床队列，提供可推广的见解，产出系列文章。
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