单细胞转录组测序技术可以深入剖析每个细胞在表达水平上的异质性。当前，这一技术已在人类生殖、发育、肿瘤学，神经科学，免疫学，以及感染性疾病等复杂生物学过程的研究中展现出了广泛的应用价值。
随着技术的持续进步，植物单细胞测序正逐渐步进入公众视野。据统计，截至2024年，依托主流高通量单细胞捕获平台（如10× Genomics、DNBelab C-TaiM 4）发表的植物单细胞研究论文数量仅200余篇，标志着植物单细胞研究领域正处于一片亟待探索的科研蓝海。
01.
植物单细胞转录组可以解决什么问题
转录组测序主要探究的是基因表达的调控机制，这一过程在植物的生长发育、非生物胁迫应答以及抗病机制研究中均扮演着关键角色。
在进行差异基因分析时，常规的bulk RNA-seq基于组织中所有细胞表达量的平均值进行计算。然而，基因表达的变化往往十分细微，并且不同细胞间的表达存在异质性。因此，在基于bulk RNA-seq分析时常会遇到一个问题，即在不同发育阶段或不同处理条件下，检测到的显著差异表达基因数量极少，可挖掘信息有限。
单细胞转录组能够将分辨率提升至单个细胞水平，从而有效避免关键基因表达差异被整体平均值所掩盖的问题。此外，在发育过程或逆境应答的早期阶段，细胞的染色质开放状态变化通常先于转录和翻译过程发生。因此，我们可以对一个细胞核同时进行转录组（RNA）和染色质可及性（ATAC）测序分析，从多组学的维度更精确解析基因表达调控网络。
02.
植物单细胞转录组的实施难点
1. 实验环节
与动物细胞不同的是，植物细胞多了一层细胞壁的支持与保护，在进行细胞捕获前需要通过酶解等手段去除细胞壁。然而在酶解过程中，存在原生质体制备存在难度大、可获取细胞类型有限、酶解导致应激基因异常表达等问题。
那么，如何消除原生质体制备导致的应激基因表达干扰呢？在2024年9月发表于Nature plants的拟南芥胚发育单细胞文章中，研究人员基于相应时间节点样本的bulk RNA-seq 进行校正，以去除应激基因异常表达干扰[1]。
除了制备原生质体的策略外，制备单细胞核悬液可以最大程度保持细胞原有状态。近年来越来越多的植物单细胞研究开始采用单细胞核测序的策略。这种策略为植物样本、复杂组织样本和珍贵冻存样本的单细胞研究提供了新的途径。
表：部分基于单细胞核转录组测序的已发表文章
针对植物样本开展单细胞核转录组测序具有以下优势：
（1）适用样本类型更广泛：新鲜样本、冻存样本、难以制备原生质体的样本均可。
（2）结果稳定可重复：无原生质体制备导致的应激基因异常表达，无酶解差异导致的部分细胞丢失。
（3）流程简化，交付提速：组织抽核实验方法成熟，项目周期短。
2. 生信分析环节
由于可参考的前人研究有限，“细胞类型注释”通常为非模式植物单细胞研究的重要环节，该环节涉及到对各细胞类型marker基因的筛选、验证等过程。
对于常见物种，可以根据参考数据库或已发表相关物种文章给出的marker基因进行注释。
表：已有单细胞文献发表的物种
对于既往单细胞研究较少的物种，由于可参考信息有限，可以通过近源物种基因同源转化的方法，来获取用于细胞类型注释的marker基因。
对前期筛选到的重要marker基因，可进行原位杂交、qPCR等验证，确定细胞鉴定的准确性。此环节也是单细胞RNA-seq不同于bulk RNA-seq的关键验证环节。
图：针对marker基因进行原位杂交验证[2]
完成细胞类型注释后，我们可以对各细胞类群数据进行深入挖掘：包括各细胞类群不同阶段 / 处理前后的数量变化；不同细胞分化轨迹分析；基于各细胞类群的差异表达基因分析、细胞类型特异性的调控网络构建等内容。
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参考文献
[1] Liew L C , You Y , Auroux L ,et al.Establishment of single-cell transcriptional states during seed germination[J].Nature Plants[2024-10-25].DOI:10.1038/s41477-024-01771-3.
[2] Cheng Z , Mu C , Li X ,et al.Single-cell transcriptome atlas reveals spatiotemporal developmental trajectories in the basal roots of moso bamboo(Phyllostachys edulis)[J].Horticulture Research, 2023, 10(8):75-87.DOI:10.1093/hr/uhad122.
