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前些天收到一位王同学的问题，说在分离药物中间体时遇到了种种困难。
“尝试了多个品牌的C18、C8柱都没有办法实现基线分离”
“不同的流动相条件也都试了，效果依然是不理想”
我们今天就仔细捋一捋这位同学的问题，也希望能给大家分离药物中间体同分异构体带来一定启发。
这就是我们要分离的三个化合物，先来分析一下它们有什么特点：
首先这三个化合物疏水性适中， 主要结构包括杂原子芳香环和卤素；主结构一致，其中两个物质为同分异构体；另外，三个化合物呈碱性，pKa较低；分子量在200左右，尺寸不大。
根据这些特点，我们考虑选择反相分离模式。由于组分之间的差异在芳香环上，优先选择芳香类固定相。
虽然理应使用缓冲体系，由于接近中性，方便起见可以尝试不用缓冲体系，有机相先选用甲醇。
被分析物的分子尺寸不大，常规120Å孔径填料可以保证良好的传质；另外，因为组分结构相近，选用等度流动相条件。
根据以上考量，我们选择三款不同的反相色谱柱进行尝试，包括最常用的C18，特殊选择性的PFP五氟苯基柱、以及立体选择性较高的C30。流动相体系用甲醇/水。
所得到的分离图谱是这样的：
我们可以看出：
在甲醇/水体系中，三种不同的反相色谱柱均能不同程度地分离2和3这两个同分异构体
C18和PFP可以达到基线分离，而C30则只能达到部分分离。
PFP和C18相比，针对此类物质的分离选择性更佳。
这是为什么呢？
我们都知道，色谱分离的基础就是找到被分析物之间的差异性，包括疏水性、极性、形状、电荷作用、偶极-偶极作用等等。
再选用适合的固定相和流动相让这些差异性更凸显，从而达到分离的目的。
对于含有杂原子和/或卤素原子的芳香类结构相似物，C18主要是根据疏水作用和形状上的差异来分离的。
而PFP不仅根据这些，还附加了固定相和被分析物之间的π-π相互作用，以及固定相中的氟原子与分析物中卤素原子的相互作用，所以就有了更好的分离选择性。
总之，分离带有卤素或杂原子的芳香类药物中间体，PFP非常适用哦！
诶？那看似这么简单的应用，为什么王同学却一筹莫展呢？
询问后我们发现王同学使用的是乙腈/水流动相体系。
那它和甲醇/水流动相体系得出的结果有什么区别呢？
我们也做了一个测试，为便于比较，采用50/50 v/v 甲醇/水和30/70 v/v 乙腈/水，以保证结构异构体的保留时间相当；除流动相外，其他所有色谱条件保持一致，用的依然是PFP五氟苯基柱。
由谱图可知，使用甲醇/水时的分离效果远远比乙腈/水体系要好。
这又是为什么呢？
PFP五氟苯基柱在色谱分离中可以提供疏水相互作用、π-π作用、氢键作用和偶极作用。
其中，固定相与被分析物之间的π-π作用对结构相似的芳香类化合物分离至关重要。
由于乙腈结构中含有不饱和碳氮三键，流动相中大量的乙腈分子包围同分异构体，大大干扰了固定相基团和被分析物之间的相互作用，导致分离能力严重下降。
所以，在使用芳香固定相分离芳香类结构相似物时，原则上优先考虑使用甲醇/水相体系。
视频看到这儿，王同学的问题基本已经解决啦！
除了PFP五氟苯基柱，大家还知道哪些常用的芳香类固定相呢？
（上下滑动查看以下内容）让我们分析看看以下三种固定相色谱柱的差异吧！
苯丙基柱设计用于芳香环和杂环化合物的分析，分离选择性主要基于疏水作用和π-π作用，与常规C18选择性互补；可用于金银花中木犀草苷的分析检测。
苯己基柱与苯丙基柱类似，分离选择性主要基于疏水作用和π-π作用，由于疏水烷基链更长，在相同基质和键合密度的情况下，疏水保留能力强于苯丙基柱，目前在血药浓度监测（TDM）应用场景中，提供良好的保留和分离选择性；
联苯基柱主要官能团是两个串联的苯环，氢原子之间存在一定的位阻，因此两个苯环之间存在一定的角度（非共平面），除提供疏水作用和π-π作用外，亦提供良好的立体选择性。
让我们用一个案例举一反三！
这是两个小分子化药中间体异构体，按照以上思路我们首先选择合适的色谱方法：
中间体Z1和Z1f是一对同分异构体，差异在于苯环上硝基的位置，故在甲醇/水流动相体系下，使用芳香固定相色谱柱进行分析。
我们用五氟苯基柱（PFP）、苯丙基柱、联苯基柱三种色谱柱得出了以下谱图
由谱图可以看到：
五氟苯基柱和苯丙基柱上，Z1和Z1f两者共流出；而联苯基柱上，Z1和Z1f两者得到良好的分离。
这就体现了三种芳香固定相色谱柱的分离选择性差异，联苯基柱为这两个异构体的分离提供了良好的立体选择性。
本期动画信息量比较大，最后给大家小结一下：
芳香类固定相具有独特的分离选择性，特别是对于含有卤素或N、S、O的芳香类小分子药物中间体分离效果显著。
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