明隆庆三年（1569年），海瑞升任应天巡抚。当时应天巡抚所辖的江南十府是明王朝财赋收入的重要来源地，也是全国最富庶的地方。但当时富甲一方的江南“水灾之后无从取民，饥民汹汹”，仅饥民就多达十三万人，大面积田地被淹导致粮价上涨。面对此情此景，海瑞立刻着手治理江南水患。他通过实地考察和查阅历任主官的治水记录，终于找到了水灾的成因：水利设施的荒废。当时太湖主要出海通道吴淞江（苏州河）堵塞严重，太湖的水泄不出去，奔涌回溢，便造成了水患。
然而，想要疏浚吴淞江是一件十分困难的事，当时甚至传唱着“要开吴淞江，除是海龙王”的童谣。海瑞当即上疏明廷，表示疏浚吴淞江河道、治理江南水患是一件刻不容缓的事。在得到朝廷批准后，海瑞立即开始治水。通过勘察，海瑞认为在经费有限的情况下，开挖新河道工程太大，“黄浦夺淞”趋势已无法逆转，在此情况下，从黄浦江泄出湖水不失为一个良策。于是，海瑞决定对黄浦江进行一次改造。
海瑞主持在邻近的古东江修坝建闸，让流经古东江的上游来水大多北折流入黄浦江。同时，海瑞又通过缩窄改深江面以增加水流冲击性，使下游吴淞江口的淤泥能被冲走。经过改造，吴淞江成了黄浦江的支流，而吴淞江下游河道泥沙淤积的问题也得到解决。
治水期间，海瑞亲力亲为筹集钱粮，发动乡绅捐济，他还上疏明廷，请将苏州、松江、常州三府的粮食全部留在当地，避免出现大灾之下有钱也买不到粮食的情况。尽管如此，当地仍然面对治水经费不足的困境。海瑞“以工代赈”招募灾民一起治水，按工发给灾民银两和口粮，既解决了治水工程缺乏劳力的问题，又解决了灾民的吃饭穿衣问题。在海瑞主持下，江南地区两个月内便疏通了八十里河道，还使十三万饥民度过了饥荒。之后连续几年，江南接连遭遇大水，都没有再出现百姓受灾的情况，一直到清代，吴淞江沿岸依然“虽有小灾，不成大害”。
海瑞为官廉洁自持、刚正不阿。他就任应天巡抚后，立即颁布《督抚宪约》，规定巡抚出巡各地，府、州、县官一律不准出城迎接，也不准设宴招待。工作餐标准，物价高的地方纹银三钱，物价低的地方两钱，连蜡烛、柴火等开支也在上述数目之内。一律不得供应鹅和黄酒，任何时候都不准超过伙食标准。
海瑞不畏强权、秉公执法。在任巡抚时，为了平均田赋徭役，严惩恩人徐阶之子，命其退田于民。在疏浚吴淞江时，看到治水官吏监工不力，将其捉拿归案、绳之以法。施行“以工代赈”时，为避免基层官员中饱私囊，给灾民发放救济粮款时他“亲给钱粮，不扣一厘，而随官人役，亦未尝摸索一钱”。他一生节俭，毫无积蓄，母亲去世时靠朋友资助才购得一块坟地，临死前还嘱咐仆人将朝廷多发的薪俸归还。
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