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哈喽小伙伴们，今天带来的又是一篇铁死亡相关的设计思路。同时我发现Advanced Science貌似对铁死亡很友好哦，前几天发的那篇铁死亡的文章也是这个杂志上的：铁死亡又登上Adv Sci！哈医大团队这次做的是“天然化合物靶向ACSL4/FTH1依赖性铁死亡途径”，干湿结合值得学习~对铁死亡感兴趣的小伙伴可以看看哦~
今天这篇文章是中国科学院覃江江研究员、程向东研究员及上海中医药大学张卫东教授团队共同完成的。研究发现了新的USP7（泛素特异性蛋白酶7）抑制剂DHPO，并揭示其诱导铁死亡的机制，为胃癌治疗提供了新的策略和理论依据。该研究结合了体外细胞实验、动物模型、scRNA测序和生物信息学分析，提供了从分子到整体的多层面证据，增强了研究结果的说服力。而且研究不仅停留在基础层面，还探讨了DHPO作为潜在药物的临床应用前景，对于转化医学研究具有重要意义。
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题目：阻断泛素特异性蛋白酶7通过靶向硬脂酰辅酶A去饱和酶诱导胃癌铁死亡
杂志：Advanced Science（IF：14.3）
发表时间：2024.5
研究背景
胃癌（GC）是一个巨大的全球健康挑战，传统治疗面临疗效限制。泛素特异性蛋白酶7 （USP7）在胃癌的发展、免疫反应和化疗耐药中起着关键作用，是一个很有前景的靶点。各种USP7抑制剂在临床前研究中显示出选择性和有效性。然而，USP7的机制作用尚未完全阐明，目前还没有USP7抑制剂被批准用于临床。
该研究的目标是开发新的特异性USP7抑制剂来治疗GC。利用已鉴定的小分子抑制剂作为实验探针，旨在探索涉及USP7的GC发生和发展的新机制和底物。此外，作者试图阐明新发现的USP7抑制剂的潜在分子机制，并评估其在治疗GC中的潜在意义。
研究思路
研究结果
GC中USP7致癌驱动因子的鉴定
作者对来自DepMap数据集的siRNA和CRISPR数据进行了全面分析，特别关注USP7。分析揭示了两个数据集中GC中USP7的显著富集，强调其与疾病的潜在相关性。随后，使用CVCDAP（一个可公开访问的癌症信息学数据库）探索了人类GC组织中USP7丰度的变化。分析显示，与正常胃组织相比，胃癌组织中USP7的mRNA表达更高。为了评估USP7对胃癌细胞增殖的影响，作者计算了TCGA、ACRG和浙江队列中所有样本中USP7 mRNA表达与Ki - 67之间的Pearson相关系数。分析表明，在所有三个数据集中，USP7和Ki‐67呈正相关。此外，作者通过128名患者的内部队列研究了USP7在胃癌中的临床相关性。通过组织微阵列免疫组化，观察到胃癌组织中USP7相对于肿瘤旁组织的上调。此外，USP7表达升高与GC预后不良相关。这些观察结果强调了USP7在胃癌中的临床意义，并强调了其作为治疗靶点的潜力。
基于硅结构的GC细胞筛选鉴定了一种新的USP7抑制剂
作者进行了基于硅结构的筛选，然后进行了细胞毒性GC细胞测定。最后，一种被称为DHPO （2α，6α‐二乙酰氧基‐4β‐羟11‐假愈血素‐12,8α‐内酯，分子量= 366 g mol−1）的化合物从两个筛选中脱颖而出，成为与USP7结合并在GC细胞中具有细胞毒性作用的首选候选化合物。作者进一步评价了该化合物的抗GC活性。结果显示，DHPO处理导致MGC803和MKN1细胞活力的浓度依赖性下降。LC/MS分析显示DHPO与重组USP7蛋白结合。为了进一步确定对结合过程至关重要的残基，作者进行了质谱分析，结果表明DHPO在GC细胞中与催化Cys300共价结合。
DHPO体外和体内抑制胃癌的生长和转移
为了进一步探讨DHPO的抗GC作用，作者对MGC803细胞进行了RNA-seq分析，并鉴定了处理和未处理细胞之间的DEGs。共有172个上调基因和266个下调基因显著差异表达。通过富集分析显示，DEGs与细胞增殖相关的信号通路以及转移相关的信号通路有关。这些结果表明DHPO抑制胃癌细胞的生长和转移。在集落形成实验中，DHPO显著降低了GC细胞的克隆生成潜能。与对照组相比，使用抑制剂处理的细胞中菌落的数量和大小明显减少。在伤口愈合实验中，与对照组相比，DHPO延迟了伤口的闭合。同样，在transwell实验中，与对照组相比，DHPO处理的细胞GC细胞的侵袭性显著降低。这些结果表明，USP7抑制剂DHPO对体外胃癌细胞的致瘤潜能具有强大的抑制作用。
使用MGC803‐Luc和MKN1‐Luc细胞系衍生的原位肿瘤小鼠模型评估DHPO的体内功效和毒性。与对照相比，DHPO处理组的肿瘤生长显著降低，且DHPO处理在任何剂量下都没有引起体重的显著变化。作者还研究了DHPO治疗对肝脏、腹膜和脾脏转移的影响。结果显示，与对照组相比，5和10 mg kg−1剂量的DHPO均能有效抑制脾脏和肝脏转移性肿瘤结节。肝脏、脾脏和肾脏等重要器官的组织学分析显示，与对照组相比，两个DHPO处理组均未出现毒性或损伤迹象。
USP7抑制剂DHPO诱导GC铁死亡
为了更深入地研究DHPO在GC细胞中的潜在机制，作者对MGC803细胞进行了基于TMT的蛋白质组学研究，DHPO或DMSO处理24小时后，共有139个蛋白表现出显著的差异表达;其中上调104个，下调35个。在DHPO处理的MGC803细胞中，差异表达蛋白在铁死亡途径中表现出初级富集。透射电镜分析显示，DHPO处理的NUGC4细胞线粒体萎缩，膜密度增强。与DMSO对照相比，DHPO处理的MGC803和AZ521细胞中的脂质ROS增加。为了特异性地敲低MGC803细胞中USP7的表达，作者使用了靶向USP7的siRNA。USP7敲低增加了脂质ROS的生成。为了进一步验证这些发现，使用靶向USP7的shRNA下调AZ521细胞中USP7的表达。与对照细胞相比，USP7敲低细胞中的脂质ROS水平升高，并且这种效应与铁下沉抑制剂Fer‐1是可逆的。无论用DHPO、FT671或P5091处理MGC803和AZ521细胞，均观察到MDA含量积累。在DHPO和FT671处理的AZ521细胞中观察到铁过载，而在P5091处理的细胞中没有观察到铁过载。在靶向USP7的shRNA感染的MGC803细胞中也观察到铁过载，这被Fer‐1逆转。
USP7通过去泛素化SCD对DHPO处理的反应调节铁死亡
为了确定USP7在铁死亡调控中的潜在底物，作者研究了DHPO处理后下调最多的10个蛋白。在这些蛋白质中， SCD是一种参与单不饱和脂肪酸生物合成的酶，在调节脂质过氧化和铁死亡中起关键作用。在MGC803、HGC27和AGS细胞中，采用Western blot和qRT - PCR方法评估USP7抑制剂DHPO对SCD表达的影响。在增加DHPO浓度处理24小时后，所有细胞系中SCD蛋白水平都以浓度依赖的方式降低，而MGC803和AZ521细胞中SCD mRNA表达以浓度依赖的方式增加。此外，当环己亚胺抑制新蛋白合成时，DHPO缩短了SCD蛋白的半衰期。MG132阻碍了SCD蛋白的降解，证实了USP7通过泛素化-蛋白酶体途径维持SCD蛋白。基于这些发现，作者提出USP7通过去泛素化SCD调节铁死亡。Co - IP验证了USP7和SCD之间的蛋白相互作用。当使用靶向USP7的siRNA或shRNA敲低USP7时，SCD的表达水平降低。与对照组相比，在MGC803细胞中敲除USP7使SCD蛋白的半衰期从5小时减少到2.5小时，表明USP7参与了SCD蛋白的稳定。敲除USP7后，DHPO对AZ521细胞SCD的抑制作用增强，进一步证实了USP7是DHPO的作用靶点。此外，USP7敲低增加了与SCD结合的多泛素链，表明USP7调节SCD去泛素化。总的来说，数据表明，DHPO对USP7的抑制增加了SCD的泛素化，加速了其蛋白酶体的降解。
USP7通过增加SCD水平促进肿瘤发生，并可作为独立的预后生物标志物
与原位肿瘤小鼠模型的结果一致，在GC PDX小鼠模型中，两种剂量的DHPO处理与对照组相比，肿瘤重量显著降低。作者还研究了DHPO对总生存率的影响。结果显示，与对照组和顺铂治疗组相比，DHPO治疗显著延长了生存期。在第36天，对照组的所有小鼠都死亡，而USP7抑制剂治疗组超过一半的小鼠存活。顺铂治疗组的生存率与对照组相似，表明在该模型中，传统化疗药物对延长总生存期的作用有限。进一步分析表明，与对照组相比，USP7抑制剂治疗组对体重没有明显的不良影响。相比之下，顺铂治疗组与其他所有组相比，体重显著减少，反映了顺铂的细胞毒性作用。总的来说，研究结果表明，5和10 mg kg - 1剂量的DHPO都能有效抑制肿瘤生长，而不会对重要器官造成明显的毒性或损伤。4 - HNE是一种高毒性且最丰富的脂质过氧化最终产物，与铁死亡有关。免疫组化结果显示，与对照组相比，DHPO处理小鼠肿瘤组织中4‐HNE蛋白的表达增加，证实了DHPO在体内诱导GC铁死亡。通过Western blot和IHC观察到USP7抑制后，GC PDX肿瘤中SCD的表达显著下调。这一发现提示，USP7抑制对SCD的下调可能有助于抑制体内肿瘤的生长。为了进一步研究USP7和SCD在空间和时间上的致癌作用，作者使用了scRNA‐seq队列并鉴定了GC细胞群。发现USP7和SCD在恶性细胞中都表现出高表达，进一步支持了USP7和SCD在GC中是强致癌基因的观点。因此，DHPO似乎是GC的一种潜在的更安全的替代或补充治疗选择。这些信息对于开发有效的癌症治疗方法至关重要，可以延长癌症患者的生存期，提高癌症患者的生活质量。
文章小结
总之，本研究提供了USP7通过抑制铁死亡作为GC治疗靶点的见解。这些发现为利用USP7降解和诱导铁死亡的GC治疗的潜在干预措施铺平了道路。
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