iMetaOmics | 刘永鑫/陈同-用于食物微生物组成和时间序列研究的微生物组数据库FoodMicroDB

FoodMicroDB：用于食物微生物组成和时间序列研究的微生物组数据库

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●  FoodMicroDB 是一个专门用于食物微生物组研究的可免费访问的数据库，数据按照项目和食物/物种归档；

●  该平台确保数据分析和元数据管理的统一性，促进跨宿主研究的比较；

●  它提供了多功能的数据可视化模块，包括用于可视化微生物组成和时间序列微生物组数据的独特工具。

引  言

食物包括未加工的农产品和加工产品，如发酵食物和包装食物。食物微生物组由与各类食物相关的微生物组成，在动植物健康、食物发酵和生产过程中发挥着至关重要的作用。靶向测序和宏基因组学的进步深入揭示了食物的微生物生态系统，阐明了它们对风味、保存、安全性以及最终对人类健康的影响。例如，人们越来越认识到发酵食物对健康的益处。关键发酵阶段的微生物群表征对于食物的稳定生产至关重要，因此得到了广泛的研究。对水果或蔬菜表面的微生物群进行了广泛研究，以促进收获后的保鲜，而植物根际微生物群对植物的生长和风味至关重要。对家畜消化道微生物组的研究对于确保动物源食物的质量和安全至关重要。 

随着食物系统微生物组研究的重要性与日俱增，大量扩增子和宏基因组测序数据已经产生。原始测序数据通常存入公共数据库，包括美国生物信息技术中心序列读取存档（National Center of Biotechnology Information Sequence Read Archive, NCBI SRA, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）、欧洲核苷酸档案 （European Nucleotide Archive, ENA, https://www.ebi.ac.uk/ena）和 中国生物信息中心组学原始数据归档库（China National Center for Bioinformation Genome Sequence Archive, CNCB GSA, https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/）。此外，MGnify 和 gcMeta 等微生物组数据库已根据宿主栖息地将处理过的数据归档，而 MG-RAST 和 Qiita则提供了额外的功能分析工具。这些数据库大大提高了数据的可访问性和可重用性。然而，这些数据库并不是专门为食物微生物组数据集设计的，缺乏对食物相关元数据的整理。另一方面，FoodMicroBioNet拥有来自 251 项已发表研究的全面的食物元分类数据集。然而，它只能通过一个 R shiny 应用程序访问，对于非 R 用户来说可能不太方便。其他平台，如 ODFM和 HoloFood，专门针对有限的食物类型，缺乏全面的微生物组数据分析和可视化模块。当务之急是建立一个具有用户友好的数据分析和可视化功能的综合性食物微生物组数据库，以促进食物科学研究。

在此，我们介绍了 FoodMicroDB，这是一个微生物组数据库，重点收集各类食物的微生物组数据，并提供数据分析和可视化功能。该数据库具有以下特点 (a) 对每个项目的宿主-食物-物种关系进行管理，实现按食物和物种进行有组织的数据管理；(b) 数据分析和元数据管理的一致工作流程，促进跨数据集分析和比较；(c) 全面的数据分析和可视化模块，有效展示微生物组成和分组比较结果；(d) 独特的时间序列分析模块，旨在跟踪纵向微生物组研究中微生物的跨时间变化。FoodMicroDB 对有兴趣探索特定食物的微生物组组成以及各种食物宿主中微生物的分布和丰度比较的研究人员来说，是一个非常有价值的参考资料。

结  果

FoodMicroDB 收集了来自 108 个元分类项目的 6,358 个食物扩增子数据，涵盖 62 种食物。除了项目与样本的关系外，我们还利用每个样本的宿主-食物-物种关系，按照相关食物和食物来源物种来组织所收集的数据。数据库中涵盖的食物包括新鲜食物（即未加工的农产品）和加工食物。对于新鲜食物，研究主要集中在描述各种植物和动物成分的微生物组，包括植物根际土壤、水果表面和动物内脏等。而加工食物的研究则是调查发酵或生产过程中微生物的变化（图 1A）。我们采用食物周期表（PTFI）食物分类法对食物进行分类。在总共 62 种食物中，有 35 种属于植物性食物，25 种属于动物性食物，另有 2 种根据其来源材料进行了分类（图 S1A）。其中，发酵食物有 29 种（占 47%，图 S1B），包括发酵饮料、乳制品、肉制品等。

为确保分析方法的一致性，我们从公共数据库（NCBI SRA/ENA/CNCB GSA）下载了所有扩增子测序数据，并使用统一的扩增子测序数据分析工作流程 EasyAmplicon对其进行了重新分析。微生物组成数据和元数据包括存储在 FoodMicroDB 中的原始数据（图 1B）。为了使每个项目的微生物组数据可视化，我们开发了微生物组成、时间序列分析和差异丰度分析模块。此外，还可在微生物信息页面下检查不同宿主的微生物丰度。通过跨食物分析模块（图 1C），可以确定某些食物或食物部分的微生物标记（通过分组比较，相对丰度发生显著变化的微生物）。

图1. FoodMicroDB总览

(A) 数据库中包含的食物微生物组项目的示意图，涵盖了新鲜食物（农产品）和加工食物。(B) 数据收集和数据库构建的流程图。(C) FoodMicroDB的主要功能：基础分析，包括微生物组成、时间序列分析和差异丰度分析；以及荟萃分析，涵盖跨宿主的微生物丰度比较和通过跨食物分析识别微生物标志物。

为了使 EasyAmplicon 分析工作流程后的微生物组数据可视化，我们开发了微生物成分分析模块。每个项目的样本信息都是从原始元数据中提取的，然后根据宿主与食物的关系进行人工编辑，在每个样本条目中显示为 “食物成分 ”和 “食物”。以黄酒发酵研究（生物项目编号：PRJNA880416）为例，该项目研究了黄酒发酵过程中醪液的微生物群谱，这对黄酒的风味至关重要。因此，“麦芽浆 ”是本研究中的食物成分（图 2A）。此外，该项目还有 16S rRNA 和 ITS 测序数据，其分析结果通过网页上不同的标签显示（图 2B）。分类群的相对丰度按食物部位分类，并以两种形式显示：整个样本的平均值和单个样本的平均值（图 2B, C）。除可视化外，处理后的数据也可在网页上下载。

图2. 微生物组成分析模块

(A) 以黄酒发酵研究（PRJNA880416）为例，展示经过整理的样本信息表。"食物"、"食物成分"、"组别"和"时间"等信息来自原始出版物的手动整理，其他信息则来自项目数元据。(B) 饼图显示了属级别微生物分类群的平均相对丰度。用户可以使用上方的选项卡选择感兴趣的界（细菌、古菌或真菌）和分类级别（从门到属）。(C) 堆叠柱状图显示了同一项目所有样本中的微生物相对丰度。柱状图的x轴上列出了从测序数据元数据表中提取的每次运行的样本名称。对于 (B) 和(C) ，图例标识了前20种最丰富的分类群，其余的归类为“其他”。通过点击图表右上角的数据表图标，可以下载原始数据。

时间序列和差异丰度分析模块，适用于有实验设计的项目

为了更好地可视化纵向微生物组数据，我们在时间序列模块中加入了更专业的可视化和分析功能。我们根据所有样本的相对丰度总和选出了丰度最高的微生物，并通过热图、冲积图和桑基图显示了它们随时间变化的丰度（图 3A、B）。所有时间点组之间的共享微生物则通过花瓣图显示。对于有多个群组的项目，我们提供了多选选项供用户选择感兴趣的群组。例如，PRJNA435900 是一个来自水稻根部微生物群时间历程研究的数据集，其中研究了两个不同农场的两个水稻品种的根部和大块土壤。在多选框中选择 “A50_Cp ”组并点击提交按钮后，会显示相应的图谱（图 3A、B）。从图中可以看出，对于 A50_Cp（昌平农场种植的日本芭蕾水稻栽培品种）样本的水稻根来说，菌属级别前 10 位的细菌总体上并不突出，而其他细菌（冲积图中的紫色）则是主要构成。通过分组选择框，用户可以快速直观地看到感兴趣样本的数据。

我们还开发了差异丰度（differential abundance, DA）分析模块，以快速直观地显示组间比较研究的结果。我们选择了两组设计的项目，并进行了差异丰度分析，以获得比较组相对丰度发生显著变化的类群。然后在交互式热图和火山图上可视化预先计算的结果。我们以甘蔗根际土壤微生物组研究为例，该研究旨在将根际微生物组与甘蔗风味联系起来。我们对甜味甘蔗和苦味甘蔗对比组进行了 DA 分析，确定了属一级的鉴别微生物类群（图 3C、D）。用户可以将鼠标悬停在每个点上，查看 DA 种类的详细信息。有趣的是，我们的结果显示甜甘蔗中富集了丘贾杆菌（Chujaibacter）和窄食单胞菌属（Stenotrophomonas），这两个属与原始出版物中列出的前 20 个分类群相吻合，从而验证了我们分析的可靠性。

图3. 高级微生物组数据可视化模块

(A, B) 时间序列项目数据可视化，带有组别选择选项，使用水稻根部和根际土壤微生物组研究的数据（PRJNA435900）。热图 (A) 和冲积图/桑基图 (B) 展示了所有时间点上最丰富的10种微生物。红色框突出显示了组别选择区域，标签如“A50_Cp”和“A50_Sz”表示不同的样本组。用户可以选择一个或多个组别。(C, D) 针对具有两组比较设计的项目的差异丰度分析，使用甘蔗根际土壤研究（PRJNA561066）作为示例。两组甘蔗（甜甘蔗和苦甘蔗）之间的差异丰度微生物（属级别）分别显示在热图 (C) 和火山图 (D) 中。使用“edgeR”方法识别出差异丰度的微生物，p值 < 0.05，FDR < 0.2，且相对丰度 > 0.1%。在 (D) 中，当鼠标悬停在点上时，会显示标记的详细信息。

检查食物相关宿主的微生物丰度

图4. 食物宿主中微生物的分布和丰度

(A) “细菌微生物”页面概览。用户可以通过上方的选项卡切换界别（细菌、真菌和古菌）和分类级别（从门到属）。(B) 显示假单胞菌的分类和宿主信息的微生物详情页。(C) 使用箱线图展示假单胞菌在各种与食物相关的宿主中的分布和丰度。

通过跨食物分析确定不同食物的微生物标记

为了找到某些食物或食物成分的微生物标记，我们开发了一个交互式跨食物分析模块。可以选择存放在数据库中的所有食物或其不同部分进行此类分析。利用骆驼奶微生物组表征研究的数据（图 5A 显示了食物信息），我们通过 LEfSe 分析发现了发酵骆驼奶和新鲜骆驼奶中的独特细菌（图 5C）。我们发现乳球菌（Lactococcus）和醋酸菌（Acetobacter）是发酵驼奶组中的富集菌属，而乳酸杆菌（Lactobacillus）和白念珠菌（Leuconostoc）则是新鲜驼奶中的富集菌属，每组中还有一些类群，这与最初的研究结果基本一致。对 ITS 数据进行了同样的比较（图 S2），发现驼奶组中变化最大的属是哈萨克斯坦酵母菌属（Kazachstania），这与原始出版物的结果一致，进一步验证了我们的分析结果。

此外，我们还支持对食物的不同部位进行比较。例如，对于苹果微生物组研究的数据（食物信息如图 5B 所示），我们对苹果的三个不同部位，即 “茎”、“茎端 ”和 “种子 ”进行了多组分析。图 5D 中的条形图显示了每个部位的微生物标记结果。最初的研究并没有进行这种比较，这说明我们的工具可以在最初的研究之外加强数据探索。

此外，网站还有一个高级功能，用于搜索时间序列项目中的微生物。在 “交叉研究”--“时间序列项目搜索 ”部分，用户还可以搜索微生物，并找到所有包含这些微生物的项目。此外，用户还可以提供序列而不是微生物名称。

图5. 跨食物分析模块

(A, B) 分别为“发酵骆驼奶”和“苹果”的食物页面。这些页面展示了食物元数据，包括生物体和分类信息、按照PTFI（食物元素周期表）方法进行的食物分类、食物部分及相关项目。发酵骆驼奶的图片来自维基百科（https://en.wikipedia.org/wiki/Chal），苹果的图片来自FooDB（https://www.foodb.ca/foods/FOOD00105）。(C, D) 通过跨食物分析模块使用LEfSe识别的差异细菌标志物。(C)中比较了“发酵骆驼奶”和“骆驼奶”，只显示了属级别的分类群。(D)中比较了苹果的种子、茎和茎端，出于清晰考虑仅显示了前5种属级别的标志物。

讨  论

讨  论

在这项研究中，我们介绍了专门用于食物微生物组研究的在线数据库 FoodMicroDB。它归档了来自 108 个宏分类项目的 6,358 个扩增子数据，涵盖 62 种食物和 4,710 个细菌、古菌和真菌类群。FoodMicroDB 是首个针对不同食物品类的配备丰富微生物组数据分析和可视化的食物微生物组数据库，主要功能包括微生物组成分析、时间序列分析和差异表达分析模块。它包含的数据经过统一的数据分析和整理流程，可进行跨宿主数据整合和比较。配备细致的的食物数据整理，如每个项目的宿主-食物-物种关系，便于搜索和导航。这个可免费在线浏览的数据库将成为食物微生物组研究领域一个重要而有价值的资源平台，使食物以及一般动植物微生物组领域的研究人员受益。未来，我们将不断更新 FoodMicroDB，提供更多数据，开发更多功能模块，更好地服务于该研究领域。

方  法

研究收集

  为了收集食物微生物组研究，我们使用关键词“[食物]”和 “微生物组 ”搜索了 PubMed 数据库（https: //pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/） 和 “微生物组”，其中“[食物]”替换为具体的食物名称，如 “苹果”、“奶酪”、“鸡肉”、“鱼 ”等。我们只保留可获得原始测序数据的研究。

数据管理和分析

   我们使用数据登录号从公共数据库下载原始测序数据和元数据。对于保存在 NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) 和 ENA (https://www.ebi.ac.uk/ena) 中的数据，我们使用了 SRA 工具包中的命令行工具。对于 CNCB GSA (https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/) 中的数据，我们使用 ftp 下载。

我们从原始上传的元数据和出版物中提取了样本元数据，并策划了一些额外的元数据，包括 “群体”、“时间”、“宿主”、“食物”、“食物成分 ”和 “生物体”。研究样本缺失的经纬度是通过使用出版物中提供的城市或国家名称在网上搜索找到的。生物分类、食物描述和食物图片通过原始出版物、维基百科（https://www.wikipedia.org/）和 FooDB 网站（https://foodb.ca/）收集。食物分类基于 PTFI 方法。微生物分类是根据 RDP（16S v18）和 UNITE（2021-05-10 所有真核生物）数据库使用内部脚本进行的。

我们采用 EasyAmplicon 工作流程对扩增片段测序数据进行重新分析，以获得分类归属和相对丰度。首先，如果测序平台产生的原始序列是成对端序列，则需要将它们合并以获得扩增片段序列；但单端序列则不需要这一步骤。随后，从原始读取序列中剔除条形码和引物，再进行质量控制，筛选出质量低的扩增片段序列，测序错误率不超过 0.01。引物长度根据出版物中的描述和对原始序列的人工检查确定。所有这些步骤都可以通过 VSEARCH完成。然后，使用 USEARCH，通过重复序列删除、噪声消除和嵌合体去除，选出有代表性的序列，并量化每个样本中代表性序列的频率，构建特征表。最后，使用 VSEARCH 和 USEARCH 分别对细菌/古细菌和真菌的代表性序列进行界、目、科、属、种和亚种分类，并利用 RDP 和 UNITE 数据库进行分类注释。

统计方法

  在差异丰度（DA）分析中，EasyAmplicon 工作流程中的脚本使用了默认设置。具体来说，在 “比较 ”功能中选择了 edgeR 方法，该方法对扩增子读数矩阵应用负二项广义对数线性模型。差异丰度类群的识别标准是相对丰度大于 0.1%，显著性阈值设定为 p 值小于 0.05，FDR 小于 0.2。在交叉食物分析模块中，使用 ImageGP 中的封装脚本和默认参数进行了 LEfSe（线性判别分析效应大小）分析。线性判别分析（LDA）得分 2 分被设定为识别标记类群的临界值。从门到属一级的标记都被识别出来。

数据库构建和网站搭建

  开源数据管理系统 Mysql (https://www.mysql.com/) 被用于保存和访问管理元数据。分类群的丰度概况以 hdf5 格式存储，以便快速访问和计算。网站以网络应用程序的形式实现，使用 Javascript 和 HTML 进行前端开发。使用的核心 JavaScript 库包括作为主要前端框架的 Vue.js (https://vuejs.org/)、用于交互式可视化和数据探索的 plotly.js (https://plotly.com/)、D3.js (https://d3js.org/) 和 Echarts.js (https://echarts.apache.org/zh/index.html)。高级网络框架 Django (https://www.djangoproject.com/) 用于后端数据预处理和数据分析。全局搜索功能基于 Elasticsearch 模块 (https://www.elastic.co/elasticsearch/)。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.8，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，是定位IF>10的高水平综合期刊，欢迎投稿！