尽管目前使用二代测序 (NGS) reads对三代测序 (TGS) reads纠错的混合方法有着较好的效果，但会将单倍型特有的variants误判成多倍体和混合样本中的错误。如何更好的利用NGS 和 TGS reads 各自的优势，实现TGS reads 的纠错至关重要。
2023年12月1日，湖南大学和德国比勒菲尔德大学研究人员合作在Genome Biology杂志在线发表题为“ Hybrid-hybrid correction of errors in long reads with HERO”的研究论文， 该文章提出了HERO算法，其作为第一个“hybrid-hybrid”的方法，通过同时利用de Bruijn graphs和overlap graphs，更好地利用NGS和TGS reads 各自的优势，解决了如何避免将phase-specific variants误判为测序error,导致过度纠错，实现了TGS reads更为精准的纠错。广泛的基准测试实验表明，HERO算法分别将indel和mismatch纠错水平平均提高了65%（27%～95%）和20%（4%～61%）。在基因组组装之前使用HERO可以大大改善组装结果。
原文链接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-023-03112-7
研究内容总结
作者首次提出,同时利用de Bruijn graph和(full-length)multiple alignments(以及overlap graphs)对三代测序reads纠错。而过往的纠错方法，仅会利用其中一种。
由此，作者建立了第一个能集成融合两个互补维度的混合纠错(HEC)方法——HERO。
它一方面结合de Bruijn graphs和overlap-based结构，另一方面发挥二代测序数据和三代测序数据reads的各自优势。是第一个double hybrid (“hybrid-hybrid”)方法。
HERO是第一个能准确为TGS read覆盖度低的基因组纠错的方法。
HERO是第一个准确为具有相似单倍型的基因组（比如在宏基因组中引用相同物种的不同菌株）纠错的方法。
HERO 介绍
HERO 是一种混合纠错方法，它利用short reads来校正long reads。
HERO 结合了de Bruijn graphs(DBG) 和overlap graphs (OG)的优点。通过 phasing reads with SNPs 来过滤掉源自其他菌株/单倍型的reads,避免过度校正。
Github：https://github.com/HaploKit/HERO
图1.HERO工作流程
黑色:long read r 为待纠正的read。黄、蓝、红:short reads，不同颜色表示不同的单倍型。红叉：表示errors。三角标记（蓝色、红色）：表示单倍型特异性variants。
HERO工作流程：
第一阶段，采用目前已有的高质量DBG-based HEC 工具（例如Ratatosk、FMLRC和 LoRDEC ）校正long reads。
第二阶段，基于(multiple) alignment (and also overlap graph)的校正，这个校正过程在方法上具有一定的创新性，由六个主要步骤组成。这六个主要步骤对应 图1中的数字。
步骤 1，计算每个 NGS reads和每个 TGS reads之间的minimizer-based all-vs-all overlaps。这里，作者使用 Minimap2，实现这一过程。
步骤 2-5 反映了HERO read phasing 和基于 MA/OG 纠错程序的技术核心。示例见图 1。
步骤 2，HERO 选择一个 TGS reads作为target read，然后计算所有与target read重叠的short reads。作者根据overlap过程中获得的 SNP 信息，对 NGS reads phasing，并过滤掉源自其他菌株的reads。在图 1中，蓝色和红色NGS读数被过滤掉，因为可以识别出特征SNP（蓝色和红色三角标记）。
步骤3，将清理后的“phase-unique”的short reads按照一小段一小段的区域进行分割。
步骤4 ，对于上一步分割的每一个区域中的subreads，通过计算 partial order alignment（POA）和consensus序列，从而得到target subreads的校正版本。
步骤 5，校正后的 target subreads被重新扩展为full-length reads。由于 target subreads已被成功校正，因此full-length reads也完成校正。
步骤6，收集所有已校正的target reads。
纠错结果评估
在文中作者使用多个数据集，清楚地展示了HERO在宏基因组中，二倍体/多倍体基因组中都能有效的降低indel error 与mismatch rates。
在这里由于篇幅有限，我们仅跟大家展示一下宏基因组中HERO的纠错水平。
测试数据集：
测试数据集作者选用了3个模拟宏基因组数据与4个真实的宏基因组数据集。
模式数据集：
模拟数据集1（3 Salmonella strains）：由 3 种沙门氏菌菌株组成的PacBio CLR reads；
模拟数据集2（20 bacterial strains）：由来自10个物种的20个菌株组成的PacBio CLR reads；
模拟数据集3（100 bacterial strains）：由来自30个物种的100个菌株组成的PacBio CLR reads。
真实数据集（都具有可用的参考基因组用于后续评估）：
Bmock12数据集：包含9个物种的11个菌株，复杂度较低。
NWC数据集:包含了3种细菌物种（Streptococcus thermophilus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus helveticus），每种物种有两个菌株。这些菌株之间的平均核酸相似性指数（Average Nucleotide Identity，ANI）分别是99.99%，99.24%和98.03%。
真实数据集1（Bmock 12 PacBio）：数据集Bmock 12对应的PacBio CLR reads
真实数据集2（Bmock12 ONT）：数据集Bmock 12对应的ONT reads
真实数据集3（NWC PacBio）：数据集NWC 对应的PacBio CLR reads
真实数据集4（NWC ONT）：NWC 对应的对应的ONT reads
HERO的纠错水平：
图2、表1、表2详细比较了不同工具纠错水平，以及HERO纠错后的indel error rates与mismatch error rates 等评估指标。
可见对于同一数据集来说，经过HERO矫正后，Indel error rates都会明显降低,同时mismatch error rates也均有降低。
如表1，图2a,在模拟数据集1（3 Salmonella strains）中,对于软件Ratatosk来说，使用HERO后的Indel error rates降低了10倍(110.75vs11.77/100kBP)，对于软件FMLRC，Indel error rates降低5倍(83.26vs17.47)；对于软件LoRDEC，Indel error rates降低5.5倍(59vs11.58)。
mismatches 的纠错效果不像indel纠错效果那么显著，不过实际上INDELS是影响TGS reads中的主要错误来源。在模拟数据集1（3 Salmonella strains）中，R-HERO产生93.9/100KBP的mismatch errors，比Ratatosk只有25%的改进(128.23 per 100 kbp)。
对于真实的4个数据集，我们可以看到NWC数据集的校正结果比Bmock 12和模拟数据集的校正结果更差。这是因为这个数据集在菌株的相似性方面存在困难(如大ANI所导致的，见上文)。此外，原始TGSreads的初始错误率比Bmock 12大得多。尽管如此，相对于仅使用DEG方法的软件，HERO依然可以更出色地完成Indel error与mismatch error的纠错（图2b,表2）。
图2.PacBio CLR和ONTreads在使用针对不同数据集的不同工具进行校正后(x轴)的Indel error rates(y轴)。Ratatosk、FMLRC 和 LoRDEC 指的是各自方法的 8 次迭代；R-HERO、F-HERO 和 L-HERO 分别指的是 Ratatosk、FMLRC 和 LoRDEC 的 3 次迭代，随后是 HERO-OG 的 5 次迭代。a模拟的 PacBio CLR reads。b PacBio CLR和ONT均读取4个真实数据集.
Indels/100KBP：每100,000个碱基indel errors的平均数。Mismatches/100 kBP：每100,000个aligned碱基平均mismatch errors的数量。基因组分数(GF)：反映了校正后的reads覆盖了每个菌株特定基因组的多少。N/100kBP：表示read中每100,000个碱基中未知碱基(NS)的平均数。MC：错误组装contigs的比例。
表1.模拟数据集中纠错的基准测试结果。
表2.真实数据集中纠错的基准测试结果。
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撰文｜徐嘉潞
