图1. 渗透胁迫下BIK1与SnRK2.6互作
研究人员首先分析了BIK1对PP2C-SnRK2复合体的影响。通过酵母三杂交实验（Y3H）（图2A）、荧光素酶互补实验（LCI）（图 2B）以及体外磷酸化实验（图2C），发现BIK1参与介导SnRK2的解抑制。渗透处理后，BIK1在酵母体系中阻止了ABI1蛋白磷酸酶和SnRK2.6的结合，且该过程依赖于BIK1的酶活。在烟草瞬时表达体系中，BIK1抑制了SnRK2.6和ABI1、HAB1等蛋白磷酸酶的互作，且该过程依赖于BIK1的酶活。在体外磷酸化实验中，PP2CA蛋白磷酸酶抑制SnRK2.6激酶活性；在BIK1存在的情况下，SnRK2.6的磷酸化逐步恢复，表明BIK1可以磷酸化修饰SnRK2.6-PP2CA复合体成员，或者通过结合释放SnRK2.6。
图2. BIK1解除PP2C对SnRK2.6的抑制
渗透介导的SnRK2释放不依赖于ABA受体PYL。ABA信号对SnRK2的释放依赖于PYL与ABI1的第180位的甘氨酸的结合。ABI1-G180D的突变阻止了PYL和ABI1的结合，从而阻断ABA介导的SnRK2释放和激活。然而，ABI1-G180D的突变不影响渗透介导的SnRK2的释放和激活（图 3A），且BIK1可以解除ABI1-G180D对SnRK2.6的抑制。这些结果表明，渗透和ABA信号介导的SnRK2.6的释放，通过影响SnRK2.6-ABI1结合的不同界面实现（图 3B）。
图3. 渗透和ABA信号介导的SnRK2.6的释放机制不同
鉴于BIK1对SnRK2.6的释放依赖于BIK1酶活，研究人员分析了BIK1对SnRK2.6和ABI1的磷酸化修饰。BIK1具有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸（Tyr，Y）激酶活性，可以磷酸化修饰SnRK2.6，但不能磷酸化ABI1。通过质谱鉴定到BIK1可能磷酸化SnRK2.6的13个位点，包括多个SnRK2自磷酸位点，以及Y163和Y182两个酪氨酸残基。利用特异识别酪氨酸磷酸化的抗体，验证了BIK1可以对SnRK2.6的Y163和Y182进行磷酸化修饰。通过AlphaFold 3模拟SnRK2.6两个酪氨酸残基进行磷酸化修饰，发现其与ABI1互作界面发生了翻转(图 4)。这表明BIK1可能通过对SnRK2.6的Y163和Y182磷酸化修饰解除PP2C对SnRK2.6的抑制。
图4. Y163和Y182磷酸化修饰解除PP2C对SnRK2.6的抑制
由于酪氨酸位点的特殊性，难以通过点突变模拟酪氨酸位点磷酸化后的状态。SnRK2.6的Y182D和Y182F突变均导致其丧失激酶活性，然而，Y163F突变的SnRK2.6的激酶活性有所增强，且ABI1和PP2CA对其抑制减弱。突变体回补实验中，仅Y163F突变的SnRK2.6可以回补ost1/snrk2.6突变体的失水表型。PP2C主要通过一个色氨酸（Trp，W）残基与SnRK2.6的Y182等残基发生互作，当突变为丙氨酸（Ala，A）或者精氨酸（Arg，R）时，PP2C和SnRK2.6的互作明显减弱，且PP2C对SnRK2.6的抑制能力减弱。这些结果进一步说明Y163和Y182残基对PP2C-SnRK2互作的重要性，并为调控作物抗旱性提供重要的基因编辑靶点。
综上，该研究通过自下而上的研究方法，鉴定到渗透信号解抑制SnRK2.6的核心蛋白激酶BIK1，并发现BIK1通过磷酸化SnRK2.6的两个酪氨酸残基，解除了PP2C磷酸酶对SnRK2的抑制(图 5)。该研究是赵杨研究组在发现质膜定位的渗透信号上游元件OSMO1/BON1 (Current Biology, 2020)，解析根冠比、避逆性等渗透信号开源应答机理之后 (Nature Plants, 2022; Developmental Cell, 2022)，进一步在渗透早期信号取得的新的突破，为提出渗透信号“复合信号”假说 (JIPB, 2024)，并继续鉴定渗透信号感受复合体和理解其感受机制提供了线索。
图5.渗透胁迫下BIK1解抑制SnRK2.6的模式图
中国科学院分子植物科学卓越创新中心赵杨研究员是该论文的通讯作者。博士生李国军和中国科学技术大学副研究员陈控博士为该论文共同第一作者。孙姝璟博士在SnRK2.6转基因回补实验中做出了重要贡献。该项研究得到中国科学院战略性先导科技专项、上海市科学技术委员会和中国科学院上海植物逆境生物学研究中心的资助。
论文链接：
https://www.embopress.org/doi/full/10.1038/s44318-024-00277-0
