优化光合效率是开发更可持续和高产作物品种的一个非常有前途的策略。这一方法有可能显著提高田间作物的农艺性状，已有几项突破性成果证明了这一点，例如构建新的光呼吸支路、提高替代电子传递途径的效率或增加热耗散NPQ。6月7日，Science Advances在线发表美国加州大学伯克利分校植物与微生物生物学系Krishna K. Niyogi课题组题为"Multiplexed CRISPR-Cas9 mutagenesis of rice PSBS1noncoding sequences for transgene-free overexpression"的最新研究论文。报道了该研究小组通过CRISPR/Cas9工具编辑植物中自然存在的参与光保护过程的基因来改变光合作用。
研究人员通过对水稻PSBS1基因上游的非编码序列进行了多重CRISPR-Cas9诱变，借助利用高通量筛选方法分离出了120个基因编辑的等位基因，基因敲除到过表达使得它们在体内具有不同的非光化学淬灭(NPQ)能力。过表达使OsPsbS1蛋白丰度增加了两到三倍，与转基因获得的倍数变化相当。PsbS 蛋白丰度的提高增强了NPQ 能力和水分利用效率。在本研究解决的遗传变异中，研究人员发现了5′UTR 插入缺失和倒位在分别驱动基因敲除/敲低和过表达表型中的作用。复杂的结构变异，如这里产生的252 kb的重复/倒位，证明了CRISPR-Cas9在促进基因组重大变化方面的潜力，而对转录组的脱靶扰动可以忽略不计。相关的研究结果可为未来针对超常等位基因的基因编辑策略提供参考，并推动了对具有加速光保护弛豫的基因编辑非转基因水稻植物的研究。
本研究中，高通量筛选编辑等位基因的大致流程如下，通过农杆菌介导的转化方法将针对PSBS1基因上游特定gRNA位点的CRISPR-Cas9构建体引入水稻愈伤组织，生成了覆盖PSBS1表达水平范围（从敲除（KO）到过表达（OX））的突变等位基因库。使用高通量叶绿素荧光筛选评估不同等位基因的NPQ能力，从78株二倍体T0植株中鉴定出稳定、可遗传的表型。其中叶绿素荧光的测量通过叶绿素荧光成像系统MAXI-IMAING-PAM完成。
另外，植物表型与蛋白表达关系的研究结果是鉴定出两种显著提高PsbS蛋白丰度和NPQ的等位基因，但OX等位基因的频率较低（1.67%）。研究发现，OX等位基因使OsPsbS1蛋白丰度增加了两到三倍，增强了NPQ能力和iWUE。PsbS丰度和NPQ之间存在对数关系，表明PsbS丰度的微小增加对NPQ能力的影响很小，这导致在筛选过程中KO/KD突变的富集。
结构变异和表型效应的研究发现，5′UTR插入/缺失和倒位在推动KO/KD和OX表型中起着重要作用。复杂的结构变异（如252-kb的重复/倒位）显著影响基因表达，而不会引起主要的脱靶转录组扰动。转录组分析显示，在重复/倒位区域内外的差异表达基因，表明基因调控的目标性和特异性。
气体交换和红光依赖的表型研究发现，PSBS1的过表达在非常高的光强下增加了NPQ能力，但也显示了在中等光强下PsbS蛋白丰度和iWUE之间的强相关性。这表明除了NPQ之外，其他因素（如类囊体醌的氧化还原状态）可能参与了在不同光照条件下调节光合作用和气孔导度。
总之，本研究的诸多发现强调了CRISPR-Cas9在通过靶向基因编辑产生显著遗传变异和改善农艺性状方面的潜力。高通量筛选方法有效地鉴定出理想表型，但OX等位基因的低频率表明随机顺式调控元件诱变的挑战。理解顺式调控机制并改进基因编辑策略，有助于开发具有显著农艺效益的小效应等位基因。
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