iMeta | 北大深圳医院桂耀庭组揭示弱精子症患者精浆微生态的动态变化及核心代谢物十六酰胺的作用机制

弱精子症患者精浆微生态动态变化及核心代谢物十六酰胺的作用机制研究

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弱精子症(AZS)是导致男性不育的常见原因之一。本研究采用16S rDNA测序和多组学分析对AZS患者精浆微生物群落和代谢物进行了全面分析。患者被分为三组：轻度AZS (AZS-I)、中度AZS (AZS-II)和重度AZS (AZS-III)。取精子活力正常的健康男性的精浆作为对照组。微生态差异分析显示，不同组精浆中微生物组成和代谢物组成存在显著差异。随后将样本分为对照组(正常组和AZS-I组)和AZS组(AZS-II组和AZS-III组)，借助相关性分析和交叉比对分析鉴定出关键的差异微生物菌属和代谢物。值得注意的是，AZS组精浆中假单胞菌，沙雷氏菌和甲基绿脓杆菌属的丰度降低，且其丰度与核心差异代谢物(十六酰胺)含量呈正相关。相反，乌鲁布鲁埃拉菌、弧菌和假交替单胞菌的丰度增加，其丰度与十六酰胺含量呈负相关。随后借助体外和活体实验证实十六酰胺可显著提高精子活力。基于代谢物靶向基因预测分析和单细胞转录组测序分析结果，我们还验证了候选靶基因PAOX和CA2的蛋白水平，结果表明十六酰胺处理后精子样品中PAOX和CA2的蛋白水平上调。综上所述，本研究揭示了AZS发病程度不同的患者精浆中6种关键菌属丰度与十六酰胺含量存在明显的差异，且6种菌属与十六酰胺存在显著相关性。此外，十六酰胺可显著提高精子活力，有可能成为AZS的治疗药物。

引  言

微生物组在生物学领域具有重大影响，但栖息在男性生殖系统中的微生物组成尚未被全面解析。越来越多的证据表明，男性精液微生物群是影响夫妻生殖健康、妊娠结局和后代福祉的关键因素。然而，尚无报道对精液微生态的组成、功能及其与男性不育症发生的关系进行深入研究。从世界范围来看，不育症的发病率已达到15%，目前排名世界第三，仅次于癌症和心血管疾病。大约一半的不育症病例归因于男性相关因素。其中，弱精子症(Asthenozoospermia, AZS)是导致男性不育的常见病因，其特征是精子活力降低。根据世界卫生组织(WHO)2010年颁布的指南，AZS患者在临床上被描述为精子总活力低于40%，前向运动活力低于32%的个体。AZS的病因是多方面的，受多种因素的影响，包括内分泌干扰物、环境压力、个人生活习惯和衰老过程，目前确切的病因仍不确定。

精浆占人类射精量的90%以上，主要由生殖道多个腺体的分泌物组成，包括尿道球腺、前列腺、尿道周围腺、附睾和精囊。最新的研究证实精液中存在独特的微生物群落，但该微生物群落在精液中的确切作用仍不清楚。此外，多项研究发现一些特定的微生物可能会影响精子质量。hou等人发现尽管健康和不育男性精液微生物群落的分布没有明显差异，但精液微生物群落中厌氧球菌的丰度可能与男性不育有关。最近的一项研究在AZS患者精液中发现了多种特定的细菌种类，如脲原体、芽孢杆菌和厌氧菌，可能会对精子质量产生不良作用。2021年，Lundy等人发现不育男性精液α多样性和β多样性的显著增加，且精液中气球菌丰度大幅增加。此外，该研究还发现假单胞菌丰度与精子浓度呈负相关，而与活动精子总数直接相关。总之，越来越多的证据表明，精液中微生物群落和精子参数之间存在潜在的联系，可能与男性不育症的发生存在一定的关联性。然而，现有的多个研究报道的结果差异较明显，因此需要进一步研究来明确男性不育症与精液微生物群落之间的关系。

近年来，许多研究还对精浆健康状态对精子活力的影响进行了报道，特别是对精浆代谢谱的分析研究，如Jayaraman等借助核磁共振进行的代谢组研究和Chen等借助液相色谱-质谱进行的代谢组研究，研究结果表明弱精子症患者精浆中潜在的生物标志代谢物主要集中于氧化应激相关通路。值得注意的是，之前的相关研究已经证实了氧化应激反应与精子发生异常之间的关联性，这也表明利用代谢组学揭示男性不育症发病机制的可行性。此外，2014年的研究证明左旋肉碱和乙酰左旋肉碱在精子代谢和成熟中的重要作用，这也加深了对男性不育潜在生物标志物的理解。2020年，Xu等人和Li等人详细对比了弱精子症患者人群与正常人群的精液代谢物组成，发现九种主要成分存在差异，包括肌酐、尿酸、N6 -甲基腺嘌呤(m6A)、尿苷、牛磺酸、肉碱、烟酰胺、N-乙酰氨基乙酸和L-棕榈酰基肉碱。上述研究结果为了解AZS患者精浆代谢物组成变化提供了初步证据，虽然上述结果具有一定程度的相似性，但由于缺乏准确和详细的患者亚组分型，其结果准确性有所欠缺。因此，仍不足以建立精浆代谢物组成改变与AZS发病之间的结论性关系。

迄今为止，尚无研究对AZS患者精浆微生态变化（包括精浆微生物群落和代谢物组成变化）进行全面细致的分析。本研究目的是描述不同人群的精浆微生物群落组成和代谢谱变化，对精浆微生态变化与AZS发病机制之间的复杂关系进行精确而严谨的研究，特别关注精浆微生态变化与AZS发生的潜在关联。此外，本研究期望确定与AZS发生直接相关的关键微生物或代谢物，希望可以为AZS临床管理筛选到可靠的候选靶标，为其临床诊治策略的发展奠定坚实的理论基础。

结  果

患者基线特征

共有120例患者参与了本研究，正常(Normal)、轻度AZS(AZS-I)、中度AZS(AZS-II)和重度AZS(AZS-III)四组人群各30例(图1A和附表1)。患者相关信息可在附表S2中查询。值得注意的是，在年龄和身体质量指数(BMI)方面，四组人群之间没有显著差异。然而，四组人群的精液参数（包括精液体积、前向性运动率、非前向性运动率、不运动精子率、精子浓度和精子形态）均观察到显著差异。基线临床特征概述见附表3。

图 1. 弱精子症(AZS)相关的微生物群落结构变化的研究设计与分析

(A)总体研究设计。轻度AZS:AZS-I;中度AZS:AZS-II;重度AZS:AZS-III。(B)利用主坐标分析(PCoA)进行β多样性分析。(C)物种组成和丰度表现:图例提供了关于每个群落中物种相对频率(%)信息。(D)不同群体的α多样性分析:(1)Observed:计算给定群落中观察到独特物种的数量。(2)Chao1:用于估算单个群落内物种真实丰富度的估计值。(3)ACE:用来评价群落内物种丰富度的估计值。(4)Shannon:衡量群落内部的多样性，同时考虑物种丰富度和均匀度。

AZS微生物群落结构变化及物种差异分析

图1B、C表明精浆中存在一个丰富多样的微生物群落，正常组人群和AZS-I组人群精浆表现出相似的群落结构，而AZS-II人群和AZS-III组人群则异于前两组，具有相似的群落结构。此外，如图1C所示，与正常组和AZS-I组相比，AZS-II和AZS-III组在几个属的组成上存在显著变化，特别是假单胞菌、沙雷氏菌、假交替单胞菌、乌鲁布鲁埃拉菌、弧菌和甲基绿脓杆菌。从alpha多样性分析(图1D)可以看出，与其他两组相比，AZS-II和AZS-III组在所有四个指数(ACE、Chao1、Observed和Shannon)上都显示出更高的数值。这一观察结果表明，在中重度AZS群体中，物种多样性有所增加，这也表明精浆中物种丰富度和多样性与中重度AZS发生之间的相关性。此外，PCoA分析结果(图1B)发现不同群体之间存在显著的差异，正常组人群和AZS-I组人群精浆的微生物群落组成具有更大的相似性，而AZS-II组人群和AZS-III组人群精浆微生物群落组成的相似性更大，上述结果为后续分析研究提供了重要的参考依据。

随后，我们根据物种注释结果，选择每个分类水平(门、纲、目、科、属)的前30个物种来绘制累积条形图，对每个样本在不同分类层级上相对丰度变化显著的物种进行可视化。如图S1A所示，与正常组人群和AZS-I组人群相比，AZS-II组人群和AZS-III组人群精浆中假单胞菌的相对丰度显著降低，而弧菌和假交替单胞菌的相对丰度显著升高，上述分析提示精浆中不同菌属的丰度变化与中重度AZS发生具有潜在相关性。此外，我们对物种注释结果进行了进一步的分析，重点关注不同比较群体中常见和独特的扩增子序列变异(ASV)。如图S1B所示，AZS-II组人群和AZS-III组人群共有954种ASV(正常组人群和AZS-I组人群没有)，其中AZS-II组人群有1917种独特的ASV，AZS-III组人群有1686种独特的ASV。相比之下，正常组人群和AZS-I组人群共有693个ASV(AZS-II组人群和AZS-III组人群没有)，正常组人群有2376个独特的ASV，AZS-I组人群有1235个独特的ASV，上述分析结果表明与正常组人群和轻度AZS组人群相比，AZS-II组人群和AZS-III组人群精浆微生物群落组成有明显的区别。

在此基础上，我们又对正常组、AZS-I组、AZS-II组和AZS-III组人群精浆微生物群落进行了差异分析。如图S1C所示，与正常组相比，AZS-I、AZS-II和AZS-III组的菌属组成均存在差异，分别有61、88和145种差异菌属。其中，AZS-I组、AZS-II组和AZS-III组分别有5、29和86种菌属丰度上调，56、59和59种菌属丰度下调。此外，与AZS-I组相比，AZS-II组和AZS-III组表现出独特的微生物特征，分别包含45和100种差异菌属。其中，在AZS-II组和AZS-III组分别有34和84种菌属上调，11和16种菌属下调。上述结果进一步表明，AZS患者的精浆微生物群落存在实质性差异，其中最显著的差异发生在中重度患者人群中。此外，我们将AZS-II vs Normal、AZS-III vs Normal、AZS-II vs AZS-I、AZS-III vs AZS-I 4个对比组进行交集比对，确定了17种与中重度AZS发生密切相关的菌属，包括假单胞菌、沙雷氏菌、甲基绿脓杆菌、乌鲁布鲁埃拉菌、弧菌和假交替单胞菌(图S1D)，这些发现进一步证明上述六种菌属在中重度AZS发生中可能存在重要作用。此外，本研究还采用LEfSe(图2A)和STAMP分析(图S2A)进行物种差异分析，并对上述六种菌属的丰度进行了展示(图2B)，结果表明这6种菌属在中重度AZS患者中显著上调或下调，为它们与中重度AZS发生的相关性提供了额外的证据。

随后，为了研究组间存在显著差异的物种，我们在物种水平上进行了假设检验，对来自不同层级的物种丰度数据使用T检验方法评估物种丰度，并绘制了这些物种在不同组别人群中的丰度分布图。结果如图S2B和S3A-C所示，将AZS-II或AZS-III组与正常或AZS-I组进行比较，发现上述六种差异菌属的丰度存在显著差异，这些发现进一步证明六种菌属在中重度AZS发生过程中存在重要作用。

图 2. 微生物群落的线性判别分析效应大小(LEfSe)和随机森林分析

(A) LDA评分组间微生物群落的LEfSe分析。(B) 6种微生物菌属的丰度分布。(C)通过受试者工作特征(ROC)曲线评价随机森林模型的性能。

AZS患者精浆微生物群落功能与环境因素的相关性研究

在阐明不同样品的微生物群落结构和物种变异之后，我们使用PICRUSt2利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库对其代谢功能属性进行了预测。首先对完成注释的功能代谢途径的相对丰度进行了聚类分析，图3A-C分别展示了主成分分析(PCA)、差异代谢物(DEM)分布模式，以及不同组间独有或共有KEGG通路的情况。此外，如图3D, E所示，以K02029, K02030, K07024为代表的功能途径在AZS-II组和AZS-III组人群中表现出相似的降低或升高趋势，而在正常组和AZS-I组人群中则表现出相应的升高或降低趋势。值得注意的是，K02029和K02030与氨基酸运输功能相关，这意味着精子活力与氨基酸运输功能之间可能存在潜在联系。此外，K07024与蔗糖磷酸酶功能相关，但其确切的作用机制还有待进一步确认研究。

在此基础上，采用Spearman’s相关性和方差划分分析(VPA)对环境因素（年龄、精子浓度、精液体积）和精液微生物群落组成之间的关系进行了相关研究，结果如图3F所示，表明精子浓度和精液体积对精浆微生物群落物种的分布具有重要的解释性，这证明精浆微生物群落对精液质量具有潜在的影响。此外，如图3G所示，假交替单胞菌和弧菌与精子浓度呈负相关，而假单胞菌与精子浓度和精液量呈正相关。这些发现为揭示精浆微生物群落和精液质量之间的密切联系提供了额外的支持，确切的机制有待进一步研究。

图3. 不同AZS患者精浆菌群功能预测及环境相关性分析

(A)主成分分析(PCA)图:基于功能预测分析的样本分布可视化。(B)不同群体中共有和独有的代谢途径。(C)不同比较组差异代谢物的统计分析。(D)基于16S测序数据经过相应功能预测后的功能途径展示。(E)不同组三种代谢途径的代谢功能显示。(F)微生物群落分布与年龄、精子浓度、精液量之间的VPA分析。(G)微生物群落分布、年龄、精子浓度和精液量之间的Spearman’s相关性分析。

AZS与精浆代谢谱有显著关联性

随后，我们对来自不同组别人群精浆的代谢组学特征进行了深入分析。如图4A和表S4所示，通过与KEGG数据库比较，共注释得到834种代谢物，其中249种代谢物(占总代谢物的29.86%)参与的代谢途径主要包括脂质代谢和氨基酸代谢(图4B)。此外，通过与人类代谢组数据库(HMDB)比较分析，共有371种代谢物(占总代谢物的44.48%)被识别，主要包括脂类和亲脂分子、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物(图S4A)。而通过与Lipid Maps数据库进行对比，识别出128种代谢物(占总代谢物的15.34%)，该亚群中的主要类别包括磷脂酸(PA)、甘油磷酸乙醇胺(GP02)、脂肪酸及其偶联物(FA01)和甘油胆碱(GP01)(图S4B)。

与微生物群落分析结果相反，PCoA分析结果表明四组之间代谢物分布的差异相对较小(图S4C)。然而，精浆差异代谢物的相似性分析(Anosim)显示各组之间存在显著差异，表明本研究中分组的重要性和正确性(图S4D)。随后的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)(图S5A)显示，与AZS-III组人群相比，正常组和AZS-I组人群精浆代谢物的空间分布更相似，而与AZS-II组人群相比也具有相似的情况，这表明正常组和AZS-I组的代谢谱表现出更大的相似性。在对代谢物进行PLS-DA分析和Anosim分析后，我们又对不同比较组(AZS-II vs Normal、AZS-III vs Normal、AZS-II vs AZS-I、AZS-III vs AZS-I)的差异代谢物进行统计分析，如图4C、D和S5B所示，与正常组人群相比，AZS-II组人群有50种差异代谢物，其中26种上调，24种下调，而AZS-III组人群有95种差异代谢物，其中19种上调，76种下调。与AZS-I组人群相比，AZS-II组人群有58种差异代谢物，其中上调40种，下调18种;AZS-III组人群有59种差异代谢物，其中上调18种，下调41种。此外，如图4E所示，通过对不同比较组前30种差异代谢物进行热图展示发现，正常组和AZS-I组人群具有相似的表达趋势，而AZS-II组和AZS-III组人群则表现出更大的相似性。其中值得注意的是，中重度AZS患者精浆中n-十四酰胺、十六酰胺和硬脂酰胺(称为核心DEMs)等特定代谢物水平显著降低；相反，3-羟基癸二酸和雌二醇显著升高(图4E)。此外，我们对四组人群精浆中核心DEMs进行了STAMP分析，发现上述三种核心DEMs在AZS-II和AZS-III患者精浆中含量显著降低(图4F)，这进一步证实核心DEMs与中重度AZS发生之间的密切联系。上述结果表明，AZS发生与精浆代谢组的改变之间存在实质性的相关性，特别是中重度AZS的发生。

此外，我们对不同比较组中差异代谢物进行相关性分析(图S6)，结果显示核心DEMs之间存在显著的正相关，这也意味核心DEMs的合成可能存在显著的相互作用。随后我们对不同比较组之间的差异代谢物进行了KEGG富集分析(图S7)并将这些富集分析结果进行交集比对，如图5A所示，结果提示我们β-丙氨酸代谢和ABC转运体可能在维持精子活力过程中发挥着关键作用，上述结果为我们后续研究工作的开展提供了重要的参考依据。

图4. 与AZS相关的精浆代谢谱的广泛变化

(A)基于不同数据库的代谢物分布。(B)基于KEGG数据库的代谢物次级代谢途径分布。(C)不同比较组差异代谢物的统计分析。(D)AZS-III组与正常组人群差异代谢物火山分布图。(E)不同患者群体的DEMs含量热图。(F)不同组人群三种代谢物的STAMP分析。

利用精浆中多组学特征预测AZS状态和亚型

随后，我们采用随机森林分析预测了四组精浆样本的微生物和代谢特征。微生物群落的受试者工作特征(ROC)分析结果如图2C所示：与正常组和AZS-I组相比，AZS-II组和AZS-III组的微生物群落组成都具有出色的诊断能力(AUC > 0.9)。这证实了精浆微生物群落作为中重度AZS分类器的识别潜力，进一步表明了精浆微生物群落在诊断中重度AZS中的临床诊断价值及其对精子运动的实质性影响。

此外，我们对不同比较组核心DEMs的ROC结果进行了统计评估。结果表明：与正常组和AZS-I组相比，AZS-II组和AZS-III组(图5B)中核心DEMs均表现出良好的诊断性能(AUC > 0.7)，且在重度AZS组中具有更强的诊断潜力。这表明精浆中核心DEMs的水平变化可作为临床评估中重度AZS的诊断工具，这一结果也强调了这些核心DEMs在影响精子活力方面所起的关键作用。

图5. 共有途径分析，核心代谢物ROC曲线分析和候选代谢物筛选

(A)四个对照组的共有途径分析。(B)不同比较组三种差异代谢物的ROC曲线分析。(C)结合不同方法筛选候选代谢物:左图为不同比较组差异代谢物的筛选情况。右图显示了不同组差异代谢物加权基因共表达网络分析(WGCNA)的结果。中间的图突出显示了候选代谢物hexadecanamide的确定。

通过综合加权基因共表达网络分析(WGCNA)代谢组学分析筛选候选代谢物

基于正常组、AZS-I组、AZS-II组和AZS-III组人群精浆微生物群落的PCoA分析和精浆代谢组的PLS-DA分析结果，我们对不同组进行了二次分类。如图5C(右面板)所示，正常组和AZS-I组微生态组成更相似可以作为对照组，而AZS-II组和AZS-III组微生态组成更相似可作为AZS组。据此分类，我们共确定了15个差异模块，每个模块代表一组与AZS发生密切相关的代谢物，然后使用这15个差异模块来进一步筛选候选代谢物。

根据差异代谢物分析和WGCNA分析的结果，我们首先从四个比较组(AZS-II vs Normal、AZS-III vs Normal、AZS-II vs AZS-I、AZS-III vs AZS-I)中选择了前15个差异代谢物进行进一步评估，如图5C(左侧图)所示，结合之前的分析结果，最终我们选择了3种核心DEMs，包括n-tetradecanamide, hexadecanamide和stearamide。随后，我们将3种核心DEMs与WGCNA分析得到的15个差异模块代谢物进行交集比对，最终鉴定出候选差异代谢物——hexadecanamide(图5C)。为了证实这一筛选结果，我们后续使用新收集的样本进行了十六酰胺的定量分析，如图6A所示，结果显示AZS患者的hexadecanamide水平显著降低，与上述代谢组学分析的结果保持一致，这一结果进一步表明十六酰胺可以影响精子活力。

图6. 候选代谢物水平的靶向定量检测及候选代谢物对精子活力的功能验证

(A)使用新采集的样品定量分析十六酰胺。p < 0.05表示差异有统计学意义。(B) 多个时间点下不同处理组的精子活力统计分析。星号(*或**)表示差异有统计学意义(p < 0.05或p < 0.01)。(C)不同处理组精子活力统计分析(左图)及不同处理组睾丸系数的统计分析(右图)。p < 0.05表示差异有统计学意义。(D)利用GEO数据库分析AZS患者精子中靶基因(PAOX和CA2)的表达。(E)不同人群精子中PAOX和CA2蛋白水平检测。(F)体外培养实验中不同处理组PAOX和CA2蛋白水平的检测。对照组，未处理组;处理组，十六酰胺处理组。(G)AZS精浆中代谢物及其微生物群落关联性分析:星号(*)表示有统计学意义的关联(p < 0.05)，其中蓝色块表示负相关，红色块表示正相关。

正常/AZS人群和小鼠少弱精子症模型中验证十六酰胺增强精子活力的作用

为了进一步证实hexadecanamide对精子活力的增强作用，我们启动了一项验证队列研究，并按照之前所述的标准化方案收集精子样本。首先我们通过预实验确定了用于精子体外培养的最适浓度-10 nM (图S8A)，随后使用重新收集的精子样本进行了更大范围的验证实验，包括来自正常组的30个样本和来自AZS组的30个样本，AZS组中23人为AZS-II，7人为AZS-III。所有精子样本均用10 nM浓度的十六酰胺处理，并分别在0 h、12 h、24 h、48 h和72 h五个时间点统计分析精子前向运动率，结果如图6B所示，hexadecanamide在不同处理组中对精子活力均有显著增强作用，而在AZS-II和AZS-III患者队列中观察到的作用效果更为显著。在此基础上，后续我们又使用腹腔注射白消安构建的少弱精子症小鼠模型对其作用效果进行进一步的验证。正式实验前我们通过预实验确定了活体实验的最适浓度（12.772μg/kg）(图S8B-D)，随后的正式实验结果证实十六酰胺在促进睾丸发育和提升精子活力方面表现出非常显著的作用效果(图6C)，上述结果证实了十六酰胺可以有效增强精子活力。

十六酰胺通过CA2和PAOX蛋白增强精子活力的机制

为了阐明十六酰胺增强精子活力的机制，我们进行了以下研究。首先，我们从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得了hexadecanamide的化学式，并基于该化学式借助SwissTargetPrediction数据库预测了hexadecanamide的靶基因集，随后按照作用概率排序进一步筛选靶基因，最终确定三个候选靶基因:CA2,CA1和PAOX(图S8E)。

在确定这些候选靶基因后，基于基因表达Omnibus(GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中现有数据集（GSE6968和GSE6872），我们对AZS患者精子细胞相关基因的表达谱进行了分析。结果如图6D所示，与正常组人群相比，AZS患者精子细胞中CA2和PAOX两个基因的表达显著下调。相反，CA1的表达没有显著差异或未检测到。此外，我们还使用人类蛋白质图谱数据库中的单细胞转录组数据进行了睾丸组织中CA2和PAOX的单细胞分辨率表达分析，结果表明，CA2和PAOX主要在晚期或成熟精子中表达，在精母细胞或精原细胞中表达最少(图S9)。这一观察结果进一步强调了CA2和PAOX在精子正常运动中的关键作用。随后我们对正常组和AZS组精子中CA2和PAOX的蛋白质水平进行了检测，如图6E所示，与正常组相比，AZS组CA2和PAOX蛋白水平显著下调，而如前所述，AZS患者精浆中十六酰胺水平的发生了明显的降低，这意味着十六酰胺水平的降低可能下调了这两种蛋白质的水平，从而降低了精子的活力。

在上述研究基础上，我们再次借助精子体外培养实验，将十六酰胺与精子共培养72小时后对来自不同处理组的精子细胞中PAOX和CA2的蛋白水平进行了检测。结果(图6F和S8F)清楚地表明，经过十六酰胺处理后，AZS组精子细胞中PAOX和CA2的蛋白水平显著增加，这证明十六酰胺可能通过提高精子细胞中靶蛋白PAOX和CA2的蛋白水平来增强精子活力。

AZS相关差异代谢特征及其关联差异菌群的共表达分析

值得注意的是，借助Pearson相关性分析对四个比较组(AZS-II vs Normal、AZS-III vs Normal、AZS-II vs AZS-I、AZS-III vs AZS-I)中差异菌属和差异代谢物之间的相关性进行了统计，结果表明精浆中物种多样性与代谢物之间存在密切的关联性(图6G、图S10和图S11)。随后对四个比较组中与核心DEMs密切相关的的差异菌属进行了交集分析，结果表明中重度AZS患者精浆中6种菌属与核心DEMs显著相关（图6G）。其中假单胞菌属、沙雷氏菌属和甲基绿脓杆菌属与核心DEMs呈显著正相关，而乌鲁布鲁埃拉菌、弧菌和假交替单胞菌呈显著负相关，上述发现为未来的研究工作提供了极有价值的参考。

基于上述研究结果，我们提出了如图7所示的生物过程概念。在此过程中，AZS患者精浆中6种菌属(Pseudomonas, Serratia, Methylobacterium-Methylorubrum, Uruburuella, Vibrio, Pseudoalteromonas)的动态变化，可能导致精浆中hexadecanamide含量的降低，进而诱发精子活力的下降，这种活力的降低与精子中两种关键蛋白质（PAOX和CA2）的下调密切相关。

图7. 概念图:研究设计中生物过程和方法框架的综合概述

诊断为AZS的患者，精浆中三种代谢物的水平显著降低(n-十四酰胺、十六酰胺和硬脂酰胺)。通过随机森林(Random Forest)、加权相关网络分析(Weighted Correlation Network Analysis, WGCNA)和多组学分析的综合使用，观察到精浆中6种菌属(Pseudomonas、Serratia、Methylobacterium-Methylorubrum、Uruburuella、Vibrio和Pseudoalteromonas)的丰度变化与十六酰胺含量变化显著相关。其中，假单胞菌属、沙雷氏菌属和甲基绿脓杆菌属的丰度显著下调，乌鲁布鲁埃拉菌、弧菌和假交替单胞菌的丰度显著上调。通过体外实验，发现精浆中十六酰胺的增加可显著提高PAOX和CA2蛋白水平，上述蛋白质水平的升高可导致精子活力的显著增强。

方  法

研究设计和纳入/排除标准

本研究的队列人群来自于青岛市市立医院(QMH, Qingdao, China)诊断为弱精子症(AZS)的患者。研究共纳入120例成人患者(n = 120)，年龄在22 ~ 45岁之间。根据AZS疾病程度将队列人群分为4组:轻度AZS (AZS-I, n = 30)、中度AZS (AZS-II, n = 30)、重度AZS (AZS-III, n = 30)和精液参数正常的对照组(正常，n = 30)(图1A)。AZS的诊断参照世界卫生组织(WHO)人类精液检查和处理实验室手册。此外，我们采用严格的标准来排除不合格的精液标本，排除标准包括精液量小于1mL；禁欲时间少于2天或超过7天；受外来物质污染或被确定为血精的标本，以保障实验结果的客观性和可靠性。本研究方案经青岛市市立医院伦理审查委员会(SZYXLL-2-2021-2-002)和深圳-北京大学-香港科技大学医学中心实验动物福利委员会(2021-850)审查批准。

生殖医学科将严格按照上述标准采集符合条件的患者精液样本，并将样品保存于-80°C冰箱中，用于后续实验。值得注意的是，为了消除实验室环境中外来微生物的污染风险，在样品采集和微生物核酸提取前一天进行了紫外线消毒。新采集的精液样本随后接受一系列常规精液临床评估，包括计算机辅助精液分析(CASA)(Suiplus精液分析-II，北京穗加软件，中国)和革兰氏染色。相关患者和样本信息见附表S1和表S2。

在完成精液采集和临床评估后，根据青岛市市立医院生殖医学科制定的指导方案，通过密度梯度法从精浆中分离精子，该过程需要对样本进行特定处理，并将所需溶液在预热培养箱中平衡过夜，每位患者约需准备4ml溶液。为了便于分离，我们配制了浓度分别为80%和40%的密度梯度离心液(K-SISG-50, William A. Cook Australia, Bloomington)。之后将1.5 mL的80%密度梯度离心溶液注入5ml试管的底部，然后将等量的40%密度梯度离心溶液轻柔地分布在试管上。同时将新鲜采集的精液置于室温下液化15-20分钟。随后用巴氏移液管将液化的精液轻轻吸入制备好的梯度溶液中，并在400g转速下离心15分钟。离心完成后，从离心管上部提取精浆，均分为两份。一份用于后续16S rDNA测序分析，另一份用于代谢组学分析，代谢组学分析采用UHPLC-MS/MS方法。

验证队列由60例患者组成(n = 60)，其中30例为正常，30例诊断为AZS，进一步细分为23例AZS-II和7例AZS-III(图1A)，其精液样本同样按照前述方案进行处理。完成收集后，这些样品被保存在-80°C冷冻状态，直到提取蛋白质或RNA。为排除实验过程中污染的可能性，我们还设置了阴性对照，该阴性对照由水和等量的空白基质组成，该空白基质不含任何微生物DNA。

DNA提取及16S rDNA测序文库建设

16S rDNA测序是微生物研究领域极其重要的方法，可以实现微生物群落的表征，包括有益微生物群落，致病微生物群落和其他微生物群落。本部分采用十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠(CTAB/SDS)法提取样品的基因组DNA，并使用附有唯一条形码特异性引物(341F: CCTACGGGRBGCASCAG；806R: GGACTACNNGGGTATCTAAT)进行基因的扩增。基因扩增产物通过Qiagen凝胶提取试剂盒(28704,Qiagen, Germany)进行纯化。随后，测序文库按照NEBNext®Ultra™II DNA文库制备试剂盒(E7645, New England Biolabs, Massachusetts)的操作方案进行制备。之后，使用Qubit@2.0 Fluorometer (Thermo Fisher, Massachusetts)和Agilent Bioanalyzer 2100系统对文库的质量进行评估。最后，将这些文库在Illumina NovaSeq平台(Illumina, California)上进行测序，产生250 bp大小的末端配对reads。

16S rDNA测序数据的质量控制与分析

16S rDNA测序数据的质量控制是保证微生物组分析可靠性和重复性的关键步骤。本研究首先对原始序列数据进行处理，去除低质量序列和适配序列。在最初的数据处理中，我们使用了一系列生物信息学工具，包括FLASH (v. 1.2.11)、fastp (v. 0.20.0)和Vsearch (v. 2.15.0)来完成特定的任务，如合并配对末端reads、质量过滤和clean tags比较。随后，使用QIIME2软件(v. QIIME2-202006)中的DADA2模块去噪，获得初始扩增子序列变体(Amplicon Sequence Variant, ASV)，然后过滤丰度低于5的ASV。利用QIIME2软件中的Silva数据库(v. 138.1)执行分类注释。

为了评估微生物群落内部的多样性，我们使用QIIME2获得7个不同的指标来量化α多样性，包括Observed、Chao1、Shannon、Simpson、Dominance、Good’s coverage和Pielou_e。此外，根据unifrac距离计算β多样性，深入了解不同组间微生物群落的差异。采用主成分分析(PCA)进行聚类分析，该分析中原始变量的降维处理主要通过R软件(v. 3.5.3)中的ade4软件包和ggplot2软件包来完成。随后，采用主坐标分析(PCoA)将多维数据中不同组间的差异可视化。此外，使用LEfSe软件(v. 1.0)进行线性判别分析效应大小(LDA评分阈值为4)分析，以识别AZS特异性的潜在生物标志物。随后，使用PICRUSt2软件(v. 2.1.2-b)进行功能注释分析，研究不同组间微生物群落的功能差异。

代谢物提取及UHPLC-MS/MS分析

将精浆标本(100μL)保存于EP管中，随后在80%预冷甲醇中进行涡旋混合再悬浮。完成上述步骤后，将样品注入LC-MS/MS系统，采用标准方案进行分析。UHPLC-MS/MS分析主要采用Vanquish UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts)和Orbitrap Q ExactiveTM HF质谱计(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts)在诺禾致源科技股份有限公司(北京，中国)进行。样品以0.2 mL/min的流速以17分钟的线性梯度注入HypesilGold柱(100×2.1 mm, 1.9μm)。正极性模式为洗脱液A(0.1%甲酸水溶液)和洗脱液B(甲醇)，负极性模式为洗脱液A为5 mM乙酸铵，pH为9.0，洗脱液B为甲醇。溶剂梯度设定为:2% B, 1.5 min;2-85% B超过3分钟;100% B浸泡10分钟;100-2% B超过10.1 min;Q ExactiveTM HF质谱计工作在正负极性模式下，喷雾电压3.5 kV，毛细管温度320℃，鞘气流量35 arb，辅气流量10 arb, S-lens RF 60V，辅气加热器温度350℃。

精浆样本的代谢组数据分析

由UPLC-MS/MS系统生成的初始原始数据在Compound Discoverer 3.1中进行处理。这一过程包括峰比较、峰选择和个体代谢物定量等步骤。随后的统计分析使用统计软件包R (v. 3.4.3)、Python (v. 2.7.6)和CentOS (v. 6.6)来组合完成。代谢物注释通过参考多个数据库实现，包括京都基因与基因组百科全书(KEGG) (https://www.genome.jp/kegg/)、人类代谢组数据库(HMDB) (https://hmdb.ca/)和脂质图谱数据库(https://www.lipidmaps.org/)。随后采用metaX软件进行主成分分析和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。鉴别差异代谢物的标准是:投射变量重要性(VIP)评分超过1，p值小于0.05，倍数变化(FC)大于或等于2，或小于或等于0.5。之后，使用ggplot2生成火山图，直观地展示差异代谢物。为进一步研究代谢物之间的关系，我们在R中使用Pearson方法借助cor.mtest()函数检验了这些代谢物之间的相关性，p值小于0.05代表具有统计学显著性，随后使用R中的corrplot软件包构建了相关性热图。此外，我们还根据KEGG数据库深入研究了代谢物相关的功能和代谢途径。

AZS患者精浆微生物组与代谢组的相关性分析

相关性分析依赖于Pearson相关系数的计算。为了直观地表示物种多样性和代谢物之间的关系和关联程度，我们在相关系数范围在-1到1之间构建了关联性热图。相关系数小于0表示负相关，而系数大于0表示正相关。同样，相关系数等于0表示零相关，从而意味着所考虑的变量之间没有任何可识别的关联。

随机森林分类分析和差异代谢物分析

利用来自16S rDNA测序的微生物组数据建立旨在识别AZS患者的预测模型。基于MicrobiomeAnalystR包的随机森林机器学习算法，建立了四种不同分类模型。每个模型都设计用于预测以下场景之一:(1)正常/AZS-II状态，(2)正常/AZS-III状态，(3)AZS-I状态/AZS-II状态和(4)AZS-I状态/AZS-III状态。这些模型的训练数据集由发现队列的患者数据组成。根据变量重要性，共选择30个预测变量进行模型构建(图2A)并借助ROC曲线评估模型功能，该过程使用R软件的metaX包中的calcAUROC函数来进行分析。

此外，我们还对差异代谢物的ROC曲线进行了绘制。ROC曲线是通过绘制各种二值分类方法而生成的，差异代谢物的ROC曲线可作为潜在生物标志物的评估工具。在图中，横轴表示假阳性率(1-特异性)，纵轴表示真阳性率(敏感性)。曲线使用R软件的metaX包中的calcAUROC()函数生成。

AZS患者精浆代谢物加权基因共表达网络分析及候选代谢物筛选

本部分我们首先通过多个比较组取交集对比筛选核心差异代谢物(DEM)。随后，随后使用WGCNA软件包对不同代谢物图谱进行了WGCNA分析，具体而言，基于筛选后的DEMs(p < 0.05和VIP≥1)，进一步确定关键代谢物。为了保证构建无标度网络，我们将β的阈值设置为6；随后采用分层聚类树形图对代谢物模块进行确认，并用热图和拓扑重叠矩阵(TOM)图可视化不同模块结构。之后将模块相关DEM与核心DEM进行交集比对，最后筛选出最重要的候选代谢物。

不同人群精浆样本中候选代谢物的定量分析

本部分采用超高效液相色谱(Ultimate 3000RS, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts)和高分辨率Q-Orbitrap质谱系统(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts)对新收集的不同人群精浆样本中hexadecanamide进行定量分析。色谱柱为Welch xextreme UHPLC C18 (2.1×100mm, 1.8μm)，温度为40°C。流动相为0.1%甲酸- 5mM甲酸铵(溶剂A)和0.1%甲酸-乙腈(溶剂B)，流速为0.30 mL/min。溶剂梯度设定为:0-1min, 70%B;1-9min，70-98%B;9-13min,98%B;13-13.5分钟,98-70%B;13.5-17.5分钟,70%B。质谱仪在全质谱扫描和平行反应监测(PRM)交替模式下工作。离子源参数设置如下:喷雾电压(3.8kV);护套气体(35arb);辅助气体(15arb);扫气(2psi);辅助燃气加热器温度320℃; S-lens RF 50V。在全扫描模式下，采用以下参数:分辨率为140,000FWHM;扫描范围100-500 m/z;自动增益控制(AGC)目标1×10⁶，最大离子注入时间100ms。PRM模式的碎片通过80%归一化碰撞能量的高能碰撞解离(HCD)实现的，分辨率为70000 FWHM, AGC目标位于2×10⁵。

候选代谢物靶基因预测和多个数据库表达谱分析

在确认候选代谢物后，我们使用Swiss target-prediction webtool (http://swisstargetprediction.ch/)来预测与候选代谢物相关的靶基因，并根据候选基因的概率值对候选基因进行排序筛选。之后，我们基于多种数据库分析了这些靶基因的表达谱，包括GEO的微阵列数据(GSE6968和GSE6872)及人类蛋白质图谱(https://www.proteinatlas.org/)数据库获取的睾丸相关单细胞RNA-seq数据。

基于候选代谢物与精子体外共培养完成精子活力评估

在确定候选代谢物和靶基因后，首先通过预实验验证候选代谢物的作用效果并确定最适作用浓度。实验过程如下:按照WHO标准对精液标本进行分类收集，将精子前向运动率低于20%的标本归类为AZS-II或AZS-III组。样本经过直接洗涤后收集精子，调整精子浓度并均分成四份。随后，使用精子培养基(510368,G-IVFTM PLUS, Vitrolife，瑞典)对四份精子样本进行体外培养，并加入不同浓度的十六酰胺(H0067, TCI，日本):0 nM, 1 nM, 10 nM和100 nM，十六酰胺在一定浓度的乙醇中溶解（最终乙醇浓度小于1‰）。按照实验设定，每个重复的最终精子浓度设为5×10⁶精子/ml, 37℃孵育，并在不同时间点(0 h、24 h、48 h和72 h)对精子活力进行统计分析。

预实验完成后，采集正常精子样本30例，AZS-II或AZS-III精子样本30例。直接洗涤获得精子，将精子浓度平分为四份。然后按预实验确定的浓度进行精子的体外培养。最后，使用CASA评估精子活力。

精子细胞中候选靶蛋白水平的检测

完成精子活力测定后，收集各处理组(共60例)的精子样本。为进一步验证该代谢物提高精子活力的机制，通过Western blotting检测了不同处理组的靶蛋白水平。首先将精子样品在冰上用RIPA裂解缓冲液(P0013C, Beyotime, China)裂解处理30分钟，提取总蛋白。随后将蛋白在4%-10%十二烷基硫酸钠凝胶(S8010, Solarbio, China)上进行电泳，然后转移到PVDF膜(ISEQ00010, MilliporeSigma, Massachusetts)上。将一抗(抗PAOX兔多克隆IgG抗体，ER65441，HUABIO，中国;兔抗CA2多克隆IgG抗体，A18034, ABclonal，中国)与膜在4℃下孵育过夜，清洗后将其与二抗(HRP偶联山羊抗兔IgG抗体，A0208, Beyotime，中国)在室温下孵育1小时。然后使用BeyoECL Plus试剂盒(P0018, Beyotime, China)进行化学发光处理，并使用化学发光检测系统(Tanon 5200, Tanon, China)成像。

候选代谢物对体外精子活力促进作用的检测

本部分实验我们参照已有文献报道，使用白消安(20mg/kg) (B2635, MilliporeSigma, Massachusetts)构建了少弱精子症小鼠模型。首先，将25mg的busulfan溶解在15ml的离心管中，离心管中含有5ml DMSO (D8370, Solarbio, China)和5ml生理盐水的混合物。完全溶解后，将离心管置于温水中以保持溶液处于合适温度。随后选择3周龄的ICR雄性小鼠(Vital River Laboratory Animal Technology, China)作为研究对象，记录它们的体重。将小鼠按体重均匀分组，每只小鼠注射8μl/g(每1g体重注射8μl)。在整个注射过程中，装有药物的离心管被置于温水中以保证其处于合适温度。将小鼠分为4组:对照组(control)、腹腔注射候选代谢物组(H)、白消安注射组(busulfan)、白消安和代谢物共同注射组(busulfan + H)，每组6只，代谢物的注射浓度选择基于预实验结果。

在经历一个完整的生精周期后，收集不同处理组小鼠的睾丸组织进行形态学检查和睾丸系数分析，此后采用计算机辅助精子分析系统(精子类分析仪®CASA系统，MICROPTIC，西班牙)统计评估不同处理组的精子质量和活力，从而证实代谢物对精子活力的影响。

统计分析

所有数据均以均数±标准差(SD)表示，采用T检验或单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析。组间数据比较采用Dunnett’s T3法或Fisher least significant difference (LSD)法。p值小于0.05可认为有统计学意义。每个实验测量至少重复三次。

讨  论

在本研究中，我们采用16S rDNA测序和代谢组学分析相结合的方法，对AZS患者精浆微生态的动态变化进行了全面分析，本研究主要目标是发现诱发AZS的潜在病因。值得注意的是，本研究发现了三种特定的代谢物，其中包括hexadecanamide，并在精浆中检测到与AZS发生显著相关的六种菌属。此外，我们在中重度AZS患者精浆中发现这六种菌属的丰度与hexadecanamide的含量之间有非常明显的关联性。

本研究中我们首次发现十六酰胺可以增强精子活力，并通过一系列体外和体内实验证实了这种作用效果，这标志着hexadecanamide具有增强精子活力的应用潜力。我们的研究结果还表明，hexadecanamide可能通过上调精子细胞中两种特定蛋白PAOX和CA2的蛋白水平来达到提高精子活力的效果。

精子活力在受精过程中发挥非常关键的作用。2003年对1085例男性不育症患者进行的调查分析显示，弱精子症的患病率很高，近81.84%的男性患者精子活力显著降低，这也证实了精子活力对维持男性生育能力的重要性。最近的多项研究越来越重视精液微生态与AZS之间的联系，之前的研究证明精液中存在独特的微生物群落，并确定了对精子质量有潜在影响的特定微生物，但对这些微生物群落与代谢物之间的关联仍未进行诠释。本研究的一个关键优势在于使用多组学方法来研究精浆的微生物群和代谢组特征，这项综合分析使我们能够更准确地评估AZS患者与健康个体精浆的微生态差异。

此外，我们的研究还发现六种菌属(特别是假单胞菌)与中重度AZS的发展之间存在显著关联性。值得注意的是，本研究与之前相关报道均表明假单胞菌的丰度与精子浓度呈负相关，并与活动精子总数直接相关。然而，考虑到16S rDNA测序技术的局限性，目前仍难以精确鉴定导致AZS发生的菌种，这也将是未来研究的重点。本研究进一步拓展了相关领域的认知，研究中筛选得到的六种菌属均包括许多单独的菌种，每个菌种具有不同的属性可能会对精子活力和男性生育能力产生不同的影响。为了推进我们对AZS的理解，提高AZS的临床诊治水平，未来的研究将致力于精确识别和验证上述菌属中与精子活力受损密切相关的特定菌株，这也将有助于以更高精准度确定微生物组与男性生殖健康之间的相关性，也将为更准确的诊断方法和有针对性的治疗干预铺平道路。本研究的另一个限制是无法利用特定的抗生素来靶向消除特定的菌属，从而验证它们在中重度AZS发展中的关键作用，这为今后的研究指明了一个新方向。

总之，我们的研究强调了精浆微生态动态变化作为精液健康的潜在指标或预测因素的重要性，未来的研究可以集中在鉴定可能导致精子活力降低的特定代谢物，并进一步评估异常丰度菌属对精子活力的影响。但毫无疑问，精浆微生态组成的阐明对于了解男性泌尿生殖系统的健康状况至关重要。

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百千华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！发行后相继被Google Scholar、ESCI、PubMed、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.7，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，同学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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