木质素衍生物，如对香豆酸和阿魏酸，是主要的生物可利用的芳香单体，有望作为微生物合成芳香天然产物的起始前体。使用木质素衍生物作为起始前体不仅减轻了前体可用性有限的问题，而且简化了合成途径。最重要的是，微生物合成符合原子经济功能化的概念，保留了木质素衍生物的芳香环结构。阿魏酸是一种甲基化苯丙酸，是木质素衍生的主要芳香单体。它已被用作大肠杆菌生物合成高圣草酚的前体。大多数4-香豆酸-辅酶A连接酶(4Cl)不能催化甲基化苯丙酸，而大多数查尔酮合成酶(Chs)不能接受甲基化苯丙酸对应的辅酶A酯。然而，一些具有广泛特异性的4Cl和Chs可以执行这些功能。工程大肠杆菌携带来自Oryza sativa的Os4CL和来自Hordeum vulgare的HvCHS，成功地从阿魏酸中合成了52 mg l−1的高圣草酚，产率为17.2%。通过携带Gm4CL(来自Glycine max)、AtCHS(来自Arabidopsis thaliana)和AtCHI(来自Arabidopsis thaliana)构建工程大肠杆菌，从酪氨酸中合成17 mg l−1的高圣草酚。高圣草酚在大肠杆菌中的生物合成效率仍然受到相关酶的异种表达性能不佳的影响。酿酒酵母也是一种很有前途的基础菌株，可以利用合成生物学工具构建异源生物合成途径。设计一个有效的酿酒酵母微生物细胞工厂用于木质素衍生物向高圣草酚的生物转化，从而促进木质素的增值和高圣草酚的生产。
图1 酵母高水平生产高圣草酚
木质素衍生物转化为高圣草酚的生物途径构建
以对香豆酸为原料，构建高圣草酚的生物合成途径。首先，将Pc4Cl、PhChs和MsChi整合到CEN.PK 2-1D的YPRCdelta15位点，从对香豆酸合成柚皮素产量为0.037 mmol l−1。通过将AtF3'H和AtATR1表达盒整合到Yzsy001的YORWdelta22位点，在没有任何柚皮素残留的情况下，获得了0.08 mmol l−1的圣草酚。将OsROMT-9、CrOMT2和VvFAOMT引入到Yzsy002中，分别生成Yzsy003、Yzsy004和Yzsy005。其中，携带OsROMT9的Yzsy003成功产生了最高滴度为0.017 mmol l−1的高圣草酚。
以阿魏酸为原料，在酿酒酵母中构建高圣草酚的生物合成途径。Os4Cl、HvChs2和HvChi的组合在酿酒酵母中可以将阿魏酸转化为高圣草酚。然而得到的菌株Yzsy006几乎没有消耗阿魏酸来产生高圣草酚。结果表明，Os4Cl在酵母中不能催化阿魏酸。进一步筛选At4Cl(Yzsy007)和Pc4Cl(Yzsy008)，并在酿酒酵母中进行工程修饰。Pc4Cl、HvChs2和HvChi结合后，阿魏酸的高圣草酚滴度为0.04 mmol l−1，产率为28.6%。通过筛选和表达外源关键酶，在酿酒酵母中成功构建了木质素衍生物合成高圣草酚的生物途径。与其他底物相比，这一成就使高圣草酚的生产具有竞争力。
图2 木质素衍生物合成高圣草酚
前体供应策略增加了高圣草酚的产量
乙酰辅酶a和丙二酰辅酶a是柚皮素生物合成的重要前体，也是酿酒酵母生产脂肪酸和脂质不可缺少的代谢物。内源性ACS1、ACS2和ACC1在酿酒酵母中过表达。结果表明，与Ynar001相比，Ynar002过表达ACC1显著提高柚皮素产量11.0%。然而，过表达ACS1或ACS2会影响细胞生长并减少柚皮素的产生。为了进一步增强乙酰辅酶A向丙二酰辅酶A的通量，在Ynar002中分别敲除内源性CIT2和MLS1，以阻止乙酰辅酶A进入三羧酸循环。结果表明，Yar005敲除CIT2后，柚皮素效价为0.045 mmol l−1，比对照菌株Ynar002提高11.0%。在Ynar006菌株中，敲除MLS1几乎没有改善细胞生长或柚皮素的产生，可能是由于MLS1的完全缺失对代谢网络产生了强烈的影响。
大多数酵母具有苯丙烯酸脱羧活性，这是由其内源性酶Fdc1和Pad1带来的。因此，在Ynar005中删除了FDC1，菌株Ynar008的柚皮素产量达到0.051 mmol l−1，提高了13.2%。在Ynar008中缺失PAD1几乎没有提高柚皮素的产量，这与之前的报道一致结果表明，酿酒酵母的内源性烯丙基还原酶Tsc13通过还原对香豆酸辅酶A，参与对香豆酸的降解TSC13是参与脂肪酸合成的重要基因，用植物中TSC13的同源基因替代TSC13可以补充TSC13的重要功能，消除不良的副反应。在Ynar010中将TSC13替换为MdECR柚皮素滴度达到0.062 mmol l−1。
关键酶的异种表达效率较差，限制了芳香族天然产物的生物合成。为了研究限速酶，使用低拷贝质粒独立过表达Pc4CL、PhCHS和MsCHI。过表达PhCHS使Ynar012的柚皮素产量为0.13 mmol l−1，比Ynar010高1.1倍。结果表明，Chs活性差是酿酒酵母合成柚皮素的限制因素之一。为了提高关键酶的活性，促进柚皮素生物合成的代谢通量，将Chs和Chi通过一个通用柔性连接体(GGGGS)n融合，进行酶融合蛋白工程。构建不同连接体数量和融合方向的酶融合表达盒，利用低拷贝质粒导入Ynar010菌株。在Ynar018中Chi-(GGGGS)1-Chs的酶融合导致柚皮素产量为0.22 mmol l−1，比没有酶融合的菌株高2.5倍。考虑到柚皮素的高供给需要限速酶的稳定表达，随后将CHI-(GGGGS)1-CHS多个拷贝整合到Ynar010的Ty3位点。得到的菌株Ynar021柚皮素产物为0.56 mmol l−1，是Ynar001的14.7倍。
随后，通过将AtF3'H和AtATR1表达盒整合到Ynar021的YORWdelta22位点，进一步构建了产周期醇菌株Yeri001。将多个OsROMT-9拷贝导入Yeri001的Ty1位点，得到的菌株Yher001成功地从木质素衍生物中获得了0.40 mmol l−1的高圣草酚。
图3 柚皮素供应工程提高高圣草酚产量
工程S-腺苷-L-蛋氨酸代谢促进了高圣草酚的合成
由于OsRomt-9是SAM依赖的O-甲基转移酶，对香豆酸合成高圣草酚的生物途径需要大量的SAM作为甲基转移的甲基供体，增加SAM的供给可以显著影响高圣草酚的合成。SAH1、ADO1、MET6和ScMET13-AtMTHFR的过表达分别加速了酵母SAM的甲基循环。结果表明，高圣草酚滴度分别显著提高22.5%、32.5%、35.2%和45.0%。这四个基因一起过表达导致Yher006的高圣草酚滴度为0.78 mmol l−1，比Yher001高95.0%。这些结果表明，促进SAM的生物合成和循环利用对O-甲基转移酶的催化反应至关重要。充足的SAM有利于木质素衍生物合成高圣草酚。
图4 提高SAM的生物合成和循环利用以提高高圣草酚产量
合理的设计和修改策略提高了OsRomt-9的活性
关键酶的催化能力决定了代谢通量的分布和目标产物的滴度。甲基转移酶的催化效率较差，通常阻碍了木质素衍生物向甲基化天然产物的生物转化。结果发现，将一份OsROMT-9表达盒拷贝转移到Yeri001中，发酵72 h后，菌株产生0.25 mmol l−1的高圣草酚，剩余0.36 mmol l−1的圣草酚，体内转化率为41.2%。推测OsRomt-9的催化效率不理想，限制了高圣草酚的完全转化。
为了获得酶-底物相互作用的准确表征，根据OsRomt-9的催化机制对对接结果进行了仔细筛选。发现Homt与OsRomt-9具有较高的序列相似性，并提出Homt的假设机制。根据序列比对结果推断，圣草酚的甲基化涉及到OsRomt-9的His274和Asp275残基对其3'-羟基的去质子化。电子从反应中心的水分子转移到His274的咪唑环上，再转移到Asp275上，导致3'-羟基成为富电子基团。最后，SAM的甲基被s圣草酚的3'-羟基亲核攻击，形成高圣草酚和SAH。
根据得到的构象选择活性位点Asn135、Ile324和Asn329作为潜在突变位点。对Asn135进行的诱变表明，突变体Romt-9N135T的底物转化率为62.6%，比Romt9WT高51.9%。随后，将突变体Romt-9N135T作为诱变Ile324的模板，突变体Romt9N135T/I324M的底物转化率为77.6%，比Romt-9WT高89.3%。基于Romt-9N135T/I324M对Asn329的诱变几乎没有提高底物转化率。
图5 合理设计和修饰O-甲基转移酶以促进高圣草酚的合成
合理的设计和修改策略提高了OsRomt-9的活性
为了提高高圣草酚的生物合成性能，将Yher006基因组中的ROMT-9WT替换为ROMT-9N135T/I324M，得到菌株Yher007。在摇瓶发酵中，菌株的高圣草酚滴度为1.0 mmol l−1，产率为65.8%。
为了评价优化后的细胞工厂的生产能力，采用优化后的发酵策略在5-L生物反应器中对Yher007进行补料发酵。补料策略首先利用葡萄糖作为碳源促进细胞生长。当OD600达到15时，每12 h向生物反应器中加入25 g L−1的对香豆酸溶液，促进高圣草酚的生物合成。两阶段发酵策略使得使用工程菌株Yher007从15.2 mmol l−1的对香豆酸生产3.2 mmol l−1的高圣草酚。结果表明，分批补料发酵过程中中间体积累较少。所构建的工程菌株对高浓度底物具有耐受性，并能产生高水平的天然芳香产物。
图6 通过组合策略设计将木质素衍生物有效生物转化为高圣草酚 的微生物细胞工厂
原文链接：
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/gc/d4gc00183d
免责声明：本文旨在分享生物合成与未来食品领域科研动态，不代表平台立场，不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准。本文也不是治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。
版权声明：标注‘原创’仅代表原创编译，本平台不主张对原文的版权。中文内容仅供参考，一切内容以期刊官网为准。
本平台转载仅仅是出于学术交流和传播信息的需要，并不意味着代表本平台观点或证实其内容的真实性；转载文章版权归原作者所有，作者如果不希望被转载或有侵权行为，请联系本平台删除。
摘译 | 张思琪
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
审核 | 刘 娟
