兰兽研：猪 B 细胞库中针对口蹄疫病毒的跨血清型广谱中和抗体的发现、识别抗原结构和进化

口蹄疫病毒（FMDV）是一种高度致病性的病原体，对猪、牛、羊等偶蹄类动物构成严重威胁。全球范围内，FMDV存在七种不同的血清型，且各血清型之间没有交叉保护作用，这使得控制和预防工作变得异常复杂。尽管已有研究致力于识别和表征广泛的中和抗体（bnAbs），但这些抗体在体内极为稀少，且往往需要多年的体细胞超突变（SHM）积累才能发展出广泛的中和能力。

2024年10月15日，兰州兽医研究所研究团队在PLOS PATHOGENS上发表题为“Discovery, recognized antigenic structures,and evolution of cross-serotype broadly neutralizing antibodies from porcine B-cell repertoires against foot-and-mouth disease virus”的最新研究论文，本研究通过构建和分析猪B细胞库，旨在快速发现针对FMDV的跨血清型bnAbs，并揭示其识别的保守抗原结构，这对于开发广谱FMDV疫苗具有重要意义。

图1. FMDV 特异性猪 B 细胞库的产生和分子表征

2.猪抗体库中共有的常见克隆型揭示了针对 Asia1 FMDV 的广泛跨血清型中和抗体

在研究中，通过对猪抗体库中O型和A型特异性的共有克隆型进行分析，发现了针对Asia1 FMDV的广泛跨血清型中和抗体。从216个共有克隆型中筛选出的20个猪源单克隆抗体（mAbs）在表达并纯化后，通过免疫荧光实验（IFA）和酶联免疫吸附实验（ELISA）验证了它们对FMDV O型和A型的特异性反应。其中，15个mAbs至少对一个代表性毒株表现出病毒中和活性，而10个mAbs显示出对O型和A型中六个流行毒株的广泛中和活性。特别地，尽管猪未接种Asia1型抗原，但这些bnAbs中有7个对Asia1 FMDV（Asia1/JS/05毒株）表现出强大的中和活性，表明接种O型和A型抗原有助于形成针对Asia1型的bnAbs。这些发现为探索针对高度变异病毒的广泛保护性FMDV疫苗提供了重要指导。

图2. O/18074 特异性和 A/AF72 特异性库中具有共同克隆型的猪单克隆抗体的中和滴度和广度

3.猪交叉血清型 bnAbs 主要靶向 VP1 上的保守“RGDL”基序，其中精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序 (RGD+1) 后的第一个残基是功能决定因素，可能模仿整合素受体识别

研究结果表明，大多数猪源广泛中和抗体（bnAbs）主要靶向口蹄疫病毒（FMDV）VP1蛋白上的保守“RGDL”基序。具体来说，9个bnAbs中有8个识别VP1的G-H环上的这一基序，其中RGD序列后的第一个氨基酸（即RGD+1位）是这些抗体识别的关键功能决定因素。这些bnAbs可能通过模仿整合素受体的识别方式来中和不同血清型的FMDV，通过阻断病毒与细胞的附着来发挥中和作用。这种模仿受体的识别机制可能为开发针对多种FMDV变异株的广泛保护性疫苗提供了新的策略。

图3.鉴定猪 bnAbs 结合表位和关键决定因素以及它们与整合素受体 (αvβ6) 识别位点的重叠

4.低温电子显微镜复合物证实了口蹄疫病毒三重轴上的新型跨血清型抗原结构，涉及 A 型和 O 型血清型中 VP2 68 (D) 上的关键决定因素

过冷冻电镜（cryo-EM）复合物的结构分析，研究确认了在FMDV的三重轴上存在一种新的跨血清型抗原结构，这一结构涉及VP2蛋白第68位的天冬氨酸（D）残基，且在A型和O型血清中都起关键作用。这一发现揭示了FMDV不同血清型间保守的抗原结构，为开发广谱中和抗体和疫苗提供了重要靶点。bnAb pOA-2特别针对这一结构，通过与VP2和VP3的相互作用，实现了对FMDV的交叉血清型中和，这为理解和设计针对FMDV的广泛保护策略提供了新见解。

图4.FMDV-O18-POA2 复合物和 FMDV-AWH-POA2 复合物的低温电子显微镜分析

图5.FMDV-O18-POA2 复合物的结构以及 FMDV O 血清型 VP2 和 VP3 的关键决定因素

图6.FMDV-AWH-POA2 复合物的结构以及 FMDV A 血清型 VP2 和 VP3 的关键决定因素

5.猪跨血清型bnAbs产生B细胞谱系的克隆进化

该研究部分探讨了产生针对FMDV交叉血清型广泛中和抗体（bnAbs）的猪B细胞克隆系的演化。通过对216个共有BCR克隆型的免疫遗传学分析，研究者们发现这些bnAbs源自5个不同的克隆谱系，涉及4种不同的重链基因（IGHV1S501, IGHV1-401, IGHV11001 和 IGHV1S201），并且HCDR3的长度从6到16个氨基酸不等。特别地，针对VP1 G-H环的9个交叉血清型bnAbs中有8个使用了相同的轻链基因IGKV2-10，表明它们在识别VP1 G-H环表位时存在趋同性。演化树显示，所有针对VP1 G-H环的7个bnAbs均源自终末分化的B细胞，这些B细胞经过多次扩增和累积大量体细胞超突变（SHMs）以获得广泛的中和能力。这些发现揭示了FMDV交叉血清型bnAbs的B细胞起源以及SHMs如何平衡中和广度和效力，为理解抗体的进化和疫苗设计提供了重要信息。

图7.猪 bnAbs 的免疫遗传学注释和产生 bnAbs 的 B 细胞谱系的进化

6.体细胞超突变平衡了中和的广度和效力

体细胞超突变（SHMs）在平衡猪源交叉血清型广泛中和抗体（bnAbs）的中和广度和效力方面发挥了关键作用。通过对bnAb pOA-2所含克隆谱系的演化树进行分析，研究人员发现，bnAbs的前体B细胞在累积不同水平的SHMs后，其对FMDV的中和能力发生了变化。初始的未突变共同祖先（UCA）在经过广泛的SHMs后，发展出早期成员163，展现出对O型FMDV的广泛中和活性。进一步的突变导致了pOA-2的形成，其中和范围扩展至O型和A型FMDV的六个代表性毒株。然而，后续的突变并未为进化后的成员162和165带来额外的中和广度，反而使它们失去了对某些毒株的中和能力。这表明，适量的SHMs对于提高同一克隆谱系内B细胞成员的中和广度至关重要，但过多的SHMs可能会偏离广泛中和的轨迹。这些发现揭示了SHMs在塑造抗体库以对抗FMDV等高变异性病原体中的复杂作用，并为设计更有效的疫苗提供了洞见。

图8.含 pOA-2 克隆谱系的猪 mAb 的进化途径和发生的 SHM

7.FMDV bnAbs 采用双重跨血清型中和机制，通过阻断其对细胞的附着和破坏病毒颗粒的稳定性

研究揭示了FMDV（口蹄疫病毒）的广泛中和抗体（bnAbs）采用双重跨血清型中和机制：一是阻断病毒与细胞的附着，二是破坏病毒颗粒的稳定性。

1. 阻断病毒附着：通过与病毒表面的特定抗原结构结合，bnAbs能够阻止病毒与宿主细胞受体相互作用，从而抑制病毒的附着和进入。这一机制涉及bnAbs模拟细胞受体，直接与病毒的整合素结合位点竞争，阻断病毒与细胞的结合。

2. 破坏病毒颗粒稳定性：除了阻止病毒附着外，某些bnAbs还能通过与病毒颗粒的特定表位结合，导致病毒颗粒结构不稳定，进而释放病毒RNA或使病毒颗粒解体。这种机制可能涉及对病毒五聚体界面的靶向，破坏病毒颗粒的整体结构，从而中和病毒。

这两种机制的发现表明，bnAbs能够通过多种方式中和FMDV，为开发能够有效对抗多种FMDV血清型的疫苗提供了重要的科学依据。

图9.猪bnAb针对FMDV血清型O和A的跨血清型中和机制的鉴定

本研究成功地从接种了FMDV O型和A型全病毒抗原的猪中分离出针对O、A和Asia1型的广泛中和抗体（bnAbs）。通过分析猪B细胞受体库，我们发现了两个不同的交叉血清型中和抗原位点，这些位点在FMDV的不同血清型中保守，为开发广谱疫苗提供了潜在靶点。

研究揭示了bnAbs通过模拟受体识别和破坏病毒颗粒稳定性的双重机制来中和FMDV，这为理解抗体如何提供针对高变异性病原体的保护提供了新的见解，并为设计更有效的疫苗策略提供了科学依据。

这些发现不仅增进了我们对FMDV交叉血清型中和机制的理解，而且为开发能够提供广泛保护的FMDV疫苗提供了重要的指导，这对于控制和预防口蹄疫这一重要动物疫病具有重要意义。

  https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012623 O

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