角鲨烯是一种无环三萜，可以刺激先天免疫细胞，促进组织修复和伤口愈合，并降低脂肪酸含量。因此，角鲨烯在制药、医疗保健、化妆品和食品行业有着广泛的应用。然而，角鲨烯的需求激增，引起了公众和科学界的担忧。对源自鲨鱼肝油的角鲨烯的需求不断增加，可能会导致过度捕捞和其他环境问题。因此，通过工程微生物可持续的生产角鲨烯已成为一种有吸引力的替代方法。
因此，该研究利用解脂耶氏酵母作为细胞工厂，构建高产角鲨烯滴度菌株。该研究首先通过筛选关键酶和辅因子工程来提高角鲨烯产量。此外，该研究还结合前体和脂滴工程，进一步提高工程化解脂耶氏酵母菌株的角鲨烯产量。最后，通过优化发酵条件，菌株YLSQ9的角鲨烯滴度达到了1628.2 mg/L。
模块化工程调节解脂耶氏酵母中的角鲨烯生物合成
作者首先分模块强化了角鲨烯合成途径。对于MVA模块，将不同来源的HMG1整合到菌株中；对于角鲨烯合成模块，将YlSQS与上述基因分别过表达。得到菌株YLSQ1-4并对比角鲨烯产量。结果表明，共表达ScHMG1和YlSQS的YLSQ1角鲨烯滴度最高，相较亲本菌株增加了约40倍。
图1 通过模块化工程提高解脂耶氏酵母中的角鲨烯产量
辅因子工程提高工程解脂耶氏酵母角鲨烯产量
角鲨烯合成依赖辅因子NADPH，该研究进一步探讨了充足的NADPH供应对解脂耶氏酵母中生产角鲨烯的影响。作者过表达了氧化磷酸戊糖途径的YlG6PD和YlPGD(解脂耶氏酵母中NADPH的主要来源)，得到菌株YLSQ5，并对比了菌株的角鲨烯产量和NADPH含量。结果表明，过表达YlG6PD和YlPGD不仅可以为角鲨烯合成提供充足的NADPH，而且可以促进YLSQ5的生长。
图2 通过辅因子工程提高解脂耶氏酵母中的角鲨烯产量
前体工程提高工程解脂耶氏酵母角鲨烯产量
为了进一步提高角鲨烯滴度，作者通过引入异源的异戊二烯醇利用途径(IUP)提高角鲨烯关键前体异戊烯焦磷酸酯(IPP)的供应。构建的菌株YLSQ6发酵72小时后，角鲨烯滴度为795.5 mg/L，显著高于YLSQ5。随后，作者对比了添加不同含量的前体异戊二烯醇(2-5 mM)对角鲨烯积累的影响。结果表明，添加2 mM和3 mM异戊二烯醇后，YLSQ6菌株角鲨烯滴度分别达到797.2 mg/L和802.1 mg/L，且进一步添加异戊二烯醇无法提高角鲨烯滴度。
图3 通过前体工程提高解脂耶氏酵母中的角鲨烯产量
脂滴工程提高工程解脂耶氏酵母角鲨烯产量
此前报道表明通过过表达DGA1可以扩大脂滴并提高角鲨烯产量。作者探讨了YlDGA1和YlDGA2过表达对角鲨烯滴度的影响。作者在菌株YLSQ5中分别过表达了这两个基因，得到菌株YLSQ7和YLSQ8。结果显示，发酵72 h后，YLSQ7和YLSQ8的角鲨烯产量分别达到776.3 mg/L和584.7 mg/L，较YLSQ5菌株分别提高了42.2 %和4.5 %。于是，作者在YLSQ7中进一步整合了上节的辅因子工程策略，得到了菌株YLSQ9。与菌株YLSQ5相比，菌株YLSQ9角鲨烯滴度更高，为868.1 mg/L，提高了62.1 %。
图4 通过联合脂滴工程和前体工程提高解脂耶氏酵母中的角鲨烯产量
优化发酵条件以提高角鲨烯的产量
由于溶解氧在微生物发酵过程中起到调节细胞生长和目标产物合成的作用。作者首先对比了有挡板摇瓶和无挡板摇瓶发酵对角鲨烯产量的影响。结果显示，在工程菌株YLSQ9中，无挡板和有挡板摇瓶的角鲨烯产量存在显著差异，使用有挡板摇瓶可能会增加发酵过程中的溶解氧水平，导致工程菌株YLSQ9角鲨烯产量下降。
作者考察了不同C/N比(10:1、20:1、40:1、60:1)对菌株YLSQ9角鲨烯产量的影响。结果显示，随着培养基中C/N比的增加，工程菌株YLSQ9角鲨烯产量逐渐降低。
作者探讨了温度（25 ℃、28 ℃ 和 30 ℃）对YLSQ9 角鲨烯产量的影响。结果显示，在28 ℃下发酵的YLSQ9角鲨烯滴度最高，为1118.6 mg/L。
作者对比了不同培养基(不同葡萄糖含量的YNB和YPD)对YLSQ9角鲨烯产量的影响。结果显示，YLSQ9在YNB-60培养基中角鲨烯产量最高，为1532.4 mg/L。
作者对比了添加不同浓度特比奈芬(0、1、1.5 和 2 mM)对YLSQ9角鲨烯产量的影响。结果显示，添加了2mM特比奈芬后产量最高，为988.2 mg/L。同时，添加了特比奈芬后影响了菌株的生长。
最终，作者综合上述优化，包括YNB-60培养基，C/N比为10:1，添加1 mM异戊二烯醇，不添加特比萘芬，无挡板摇瓶，培养温度为28 ℃。在优化的发酵条件下，YLSQ9角鲨烯产量提高到1628.2 mg/L。
图5 优化发酵条件提高YLSQ9中角鲨烯产量
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852423016619?via%3Dihub
免责声明：本文旨在分享生物合成与未来食品领域科研动态，不代表平台立场，不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准。本文也不是治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。
版权声明：标注‘原创’仅代表原创编译，本平台不主张对原文的版权。中文内容仅供参考，一切内容以期刊官网为准。
本平台转载仅仅是出于学术交流和传播信息的需要，并不意味着代表本平台观点或证实其内容的真实性；转载文章版权归原作者所有，作者如果不希望被转载或有侵权行为，请联系本平台删除。
摘译 | 赵逸飞
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
审核 | 刘 娟
