大肠杆菌BL21无法将葡萄糖分解为3-HP，因为它缺乏将MCA转化为3-HP所需的MCR。因此，首先在BL21菌株中通过表达MCR.21建立了功能性MCA途径（图 1a）。MCR分为MCR-N和MCR-C。先前的研究结果表明，将MCR分为这两个单独的域可以增强MCR的整体活性。MCR-N（由mcr-n编码）和MCR-C（由mcr-c编码）在质粒pETDuet-1中通过强启动子T7进行异源表达，得到pET-mcr-n-mcr-c。将质粒导入BL21菌株，获得重组菌株ECM01，该菌株从20 g/L葡萄糖中生产0.3 g/L 3-HP，对应的产量为0.1 mol/mol（图1b、c）。为了进一步提高3-HP的生物合成，在ECM01中用其突变体mcr-cN940V/K1106W/S1114R（以下简称mcr-cM）取代mcr-c基因（图1a），得到一株新的重组菌株，命名为ECM02。所得工程菌株ECM02的3-HP产量为0.6 g/L，与ECM01菌株的滴度相比增加了约2倍（p<0.05），产量几乎相同，为0.1mol/mol（图1c）。
图1 大肠杆菌底盘改造及3-HP合成途径构建
接下来作者重新平衡生物合成途径并增强前体供应。由于之前的研究只考虑了MCR的突变，而另一研究考虑了ACC与MCR之间的平衡，因此，为了使关键酶片段的表达水平达到更好的平衡，进一步利用不同拷贝数的质粒对mcr-cM和mcr-n进行调控。尽管通过定点突变提高了MCR-C的活性，但MCR-N的活性仍然高于MCR-C，考虑到MCR-N的活性仍然高于MCR-CM，因此将mcr-n引入超低至中拷贝数的质粒中，将mcr-cM引入高至超高拷贝数的质粒中，以平衡两个酶片段的表达水平（图2a）。其中，超低、低、中拷贝数的mcr-n分别在pCOLADuet-1、pACYCDuet-1和pCDFDuet-1中表达，而将mcr-cM引入pET28a（高）和pRSFDuet-1（超高）质粒中。以此方式，将新构建的含有mcr-n和mcr-cM的质粒共转化到BL21菌株中，共产生6株重组菌株（命名为ECR01至ECR06）。如图2a所示，菌株ECR02表现出优异的3-HP生产性能，其中mcr-n和mcr-cM分别位于pACYCDuet-1（低）和pET28a（高）质粒上。ECR02菌株的3-HP滴度和产量分别为0.9 g/L和0.2 mol/mol（图2b，d），与ECM02菌株的3-HP滴度和产量相比分别高出50％和100％。为了增强乙酰辅酶A的合成，通过引入质粒pACYC-mcr-n-accADBC在ECR02中表达accA、accBC和accD基因，产生新菌株ECM03。菌株ECM03的3-HP滴度和产量分别为1.5 g/L和 0.2 mol/mol（图2c、d）。这些结果表明，ECM03的3-HP滴度比ECR02菌株高出66.7%，产量几乎相同（0.2 mol/mol）。相反，72小时后，ECM03的生长比ECR02菌株的生长减少了13.8%（图2d）。细胞生长的下降可能是由于ACC的过度表达导致从乙酰辅酶A节点流向TCA循环的碳流量减少。此外，乙酸具有毒性，过高的乙酸浓度可能会抑制细菌的生长。ECM03的副产物乙酸为5.2 g/L，比ECR02菌株的乙酸产量（4.9 g/L）高出约6.1%（图2d）。
图2 重新平衡代谢途径并增强前体供应以促进3-HP生物合成
乙酰辅酶A供应可能是化学物质生物合成的主要瓶颈。理论上，每个葡萄糖分子通过内源性EMP途径生成两个乙酰辅酶A分子，而通过NOG途径可以获得三个乙酰辅酶A分子（图3a）。然而，后一种途径在能量代谢中可能通过NOG产生的还原当量不足，从而不利于3-HP的生物合成。因此，本文构建了混合EMP途径，通过将EMP途径与NOG相结合来替代性地改善乙酰辅酶A。这种混合途径不仅可以从每个葡萄糖分子产生2.5个乙酰辅酶A分子（图3a），而且不会抑制细菌的能量代谢和正常生长。EMP-NOG混合途径表现出从乙酰磷酸（AcP）生成乙酰辅酶A的增强能力。
此外，在质粒pCDFDuet-1中将基因fxpk、tal和actA在强启动子T7下表达，得到pCDFfxpk-tal-actA。将质粒pCDF-fxpk-tal-actA转化ECM03ΔpfkA，得到工程菌株ECF01。然后在pfkA基因缺失的基础上，进一步敲除gapA基因，构建ECM03ΔpfkA-gapA，从而阻断G3P转化为乙酰辅酶A，使碳通量只流向NOG途径。当质粒pCDF-fxpk-tal-actA转化到ECM03ΔpfkA-gapA，获得工程菌株ECNOG，并引入NOG途径。将ECM03ΔpfkA、ECNOG和ECF01菌株以1%的接种量接种到含有20 g/L葡萄糖的M9培养基中，结果发现ECM03ΔpfkA和ECNOG的生长受到葡萄糖的抑制，在ECM03ΔpfkA和ECNOG的72 h发酵液中均未检测到3-HP，同时葡萄糖几乎不被消耗（图3b、c），证明ECM03ΔpfkA中pfkA基因的敲除成功阻断了EMP途径的起始阶段，导致其能量代谢受到抑制，菌体不能正常生长。此外，ECNOG中NOG途径的能量代谢受到抑制，严重影响了ECNOG菌株的生长和3-HP的生物合成。而ECF01生长正常（图3b），表明混合EMP途径成功引入ECF01（图3f）。另一方面，菌株ECF01的3HP滴度和产量分别为2 g/L和0.4 mol/mol，分别比ECM03高33.3％和100％（图3d）。研究发现，ECF01菌株的乙酸盐产量约为2.8 g/L，而ECM03菌株的乙酸盐产量为5.2 g/L（图3e）。相应地，ECF01菌株的乙酸产量与ECM03菌株相比下降了46.2%。据推测，ECF01中actA基因的表达导致乙酸被利用来产生更多的乙酰辅酶A。因此，与ECM03菌株相比，ECF01菌株的生长速度更快（图3d）。这一结果证明，通过引入NOG途径（混合EMP途径）对EMP途径进行早期修改，可以实现更好的促进3-HP的合成。
图3 调节EMP的初始阶段并与NOG通路协同作用
酶的表达水平直接影响3-HP的合成，而5′-UTR工程可以有效预测和调节表达水平。因此，本研究利用该技术平衡accADBC，fxpk，tal和actA的表达（图4a）。accADBC、fxpk、tal、actA的原始表达量分别为1795401.3、708696.4、82438.1au，根据5′-UTR最高表达量预测，accADBC、fxpk、tal和actA的表达量分别为4474448.5、1605392.9、197107.4au。对ECF01中accADBC、fxpk、tal和actA基因的5′-UTR序列进行优化后，获得了ECF02。该重组菌株摇瓶发酵后最终的3-HP滴度和产量分别为2.4 g/L和0.4 mol/mol（图4c、d）。与ECF01菌株相比（图4b），ECF02菌株的3-HP产量显著提高，滴度高出约20%（图4d）。此外，经过5′-UTR设计后，ECF02副产物乙酸产量从2.8 g/L降至1.2g/L，降低了57.1%（图4d）。
图4 相关基因表达水平的调控
当产生一个3-HP分子时，至少消耗了2个NADPH分子（图5a）。调节MCA途径的NADPH供应是必不可少的。因此，引入了NADP+依赖的3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapN)，通过促进NADP+转化为NADPH来恢复NADPH。该反应最终可以增加MCA途径中的NADPH供应(图5a)。从大肠杆菌中选择天然启动子pgapA，构建连接片段pgapA-gapN。从低到高设计了三个5′-UTR序列，分别为33524.1、244877.3和443515.9au(图5b)，以微调gapN的表达水平。最终得到菌株ECF03、ECF04、ECF05(图5b)。在摇瓶发酵中，ECF03、ECF04、ECF05最终的3-HP滴度分别为4、1.9、1.1 g/L（图5c），因此，表达水平较低的ECF03在3株重组菌株中表现出最好的3-HP生产能力。由于NADPH的有效供应，发酵初期3-HP产量显著提高。此外，还发现ECF04和ECF05菌株的OD600值低于ECF03菌株（图5d），这可能是因为ECF04和ECF05菌株的还原能力过强，对细菌的生长不利。相反，表达水平较低的ECF03生长最快，3-HP产量最高。值得注意的是，ECF03产生的副产物也很少，乙酸盐产量为0.9 g/L，比菌株ECF02低25%。由于乙酸盐的毒性，较低乙酸盐浓度的ECF03生长更好（图5f）。ECF03随时间变化的发酵曲线如图5e所示，72小时后3-HP的最大滴度达到4 g/L，产量为0.6 mol/mol，与ECF02相比，工程菌株ECF03的滴度和产量分别提高了约66.7%和50%（图5g）。在前期通过基因gapN平衡氧化还原状态的研究中，大肠杆菌JA04的1,3-PDO合成量为5.9g/L，比天然菌株（大肠杆菌JA03）高出87.7%，证明了胞内氧化还原状态对微生物代谢的重要性。
图5 辅助因子优化促进3-HP合成
选定ECF03作为最优菌株进一步研究优化发酵培养基成分和IPTG浓度。根据细菌生长曲线，0.1 mM和0.25 mM IPTG诱导下，菌株的OD600值低于0.05 mM IPTG（图6a）。IPTG浓度为 0.05、0.1和0.25 mM时，最终3-HP滴度分别达到4.1、2.3和2.2 g/L（图6a）。此外，在M9培养基中，0.05mM IPTG诱导下3HP产量为0.7 mol/mol（图6c）。因此，进一步优化发酵培养基成分后，葡萄糖仅剩下约1.3 g/L（图6b），在发酵后期几乎消耗殆尽。分析菌体生长曲线可知，与M9培养基中的对照菌株ECF03相比，在M9培养基中添加金属离子后，OD600值也较高（图6c），推测金属离子的添加可以满足菌体对某些微量元素的需求。同时发现醋酸盐产量比原M9培养基降低了62.6%（图6c）。工程菌株ECF03在改良的M9培养基中表现出的滴度比从原始M9培养基增加了65.9％（图6b，c）。
为了进一步评估ECF03生产性能，在生物反应器中进行补料分批发酵。如图6d所示，3-HP生产率在12小时前一直较低，为0.2g/(L·h)。相反，3-HP生产率在24小时后增加，特别是在36到48小时之间，生产率达到约0.8g/(L·h)。然而，细胞生长在48小时后下降，在60到72小时之间达到稳定期。最终的滴度、生产率和产量分别为42.8g/L、0.6g/(L·h)和0.4mol/mol。
图6 发酵优化提高3-HP产量
原文链接：
https://doi.org/10.1021/acssynbio.4c00427
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摘译 | 胡方林
编辑 | 王咏桐
左莎莎
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