1、文献题目
MOF-derived bimetallic nanozyme to catalyze ROS scavenging for protection of myocardial injury
文献期刊：Theranostics
10.7150/thno.83543
2、文献提出的科学问题
具有高催化活性和底物选择性的天然酶被用于抗炎以及清除体内多余的活性氧，但制造和储存成本高、生物不稳定性、低可回收性和潜在的免疫原性等固有缺点阻碍了它们的临床应用。
3、分解为几个研究目标
1、制备超薄片状形貌的Cu-TCPP，并通过水热法掺杂Mn形成双金属MOF纳米粒子（Cu-TCPP-Mn）。
2、通过XPS进一步证实了Cu-TCPP-Mn纳米酶的化学成分以及体外模拟级联SOD和CAT活性的能力。
3、评估了Cu-TCPP-Mn纳米酶对急性心肌梗死小鼠模型的ROS清除和抗炎作用以及了解纳米酶对MI小鼠心脏功能和心脏重塑的长期保护作用。
4、研究总体方案
基于生物启发我们开发了一种双金属MOF纳米酶来模拟级联SOD和CAT清除ROS的活性。集成的Cu-TCPP-Mn纳米酶制备简单并含有含有丰富的铜活性和锰活性中心，具有很高的催化效率。动力学分析和产氧速率分析表明，Cu-TCPP-Mn纳米酶具有良好的SOD和CAT活性。
5、方法和技术手段
SEM、TEM、AFM、FTIR、XPS、XRD、UV-vis、同步辐射、 Fluorescent spectra、MTT
6、主要研究成果
1、通过透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)证实了Cu-TCPP的成功制备，显示了制备的Cu-TCPP结构的超薄片状形貌，原子力显微镜(AFM)显示Cu-TCPP结构的厚度为10.52±0.21 nm。将MnCl2·4H2O和Cu-TCPP在N, N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中的混合物在90℃下加热过夜，形成双金属MOF纳米粒子（Cu-TCPP-Mn）。合成的Cu-TCPP-Mn保持片状形貌，粒径约为100nm。超声6 h后，离心纯化Cu-TCPP-Mn纳米点。TEM图像显示高度分散的纳米点，均匀大小为20 nm。此外，合成的Cu-TCPP-Mn在不同pH值的缓冲液中表现出良好的稳定性。AFM显示Cu-TCPP-Mn纳米点的平均厚度为2.34±0.06 nm。紫外可见光谱显示，Cu-TCPP- mn纳米点的吸收峰位于420 nm和540 nm处，而Cu-TCPP的吸收峰位于434 nm处。
2、通过XPS进一步证实了Cu-TCPP-Mn纳米酶的化学成分，发现Cu-TCPP和Cu-TCPP-Mn在397.725 eV处存在Mn，在400.900 eV处有吡咯氮的还原。粉末x射线衍射(PXRD)表明，Cu-TCPP-Mn具有特征峰，结晶度较高。ICP-AES结果显示Cu- TCPP -Mn纳米酶中Mn和Cu的含量分别为2.89%和11.83%，与文献报道相似，而Cu在Cu- TCPP中的含量为14.13%，表明加入Mn2+可以取代Cu2+的螯合作用。X射线吸收近边缘结构(XANES)光谱和扩展X射线吸收精细结构(EXAFS)光谱，并证明了Cu-TCPP-Mn纳米酶具有明确的MnN4化学结构。Cu- K-edge EXAFS和XANES也证实了Cu- O在Cu- TCPP和Cu- TCPP - Mn中的配位峰，Cu-TCPP-Mn的Zeta电位为-14.8±2.12 mV。Cu-TCPP在1720 ~ 1200 cm-1之间出现多个峰值，分别代表C=O的对称振动模式(1606 cm-1)、O=C-O的非对称振动模式(1661,1403 cm-1)和O=C-O的对称振动模式(1342 cm-1)。这些表征表明TCPP配体中的羧基与Cu原子的配位导致了苯环的不对称拉伸。Cu-TCPP-Mn纳米酶在999 cm-1处出现左移峰，在1714 cm-1处出现消失峰，证实了Mn(II)与TCPP配体的结合。这些结果表明Cu-TCPP-Mn纳米酶的成功合成。
2、我们进一步评估了它们在体外模拟级联SOD和CAT活性的能力。因为人们普遍认为清除。O2 -是抗ROS级联反应系统中必不可少的步骤，我们首先通过监测O2-的消除来研究它们的SOD样活性。通过将黄嘌呤(X)和黄嘌呤氧化酶(XO)与或不与纳米酶混合，产生和消除O2 -可通过NBT在550 nm的吸光度处动态检测。Cu-TCPP和Cu-TCPP- Mn纳米酶均表现出类似SOD的活性，且呈浓度依赖性。此外，研究了纳米酶在不同pH和温度条件下的类SOD活性。Cu-TCPP和Cu-TCPP- Mn在pH为5.5 ~ 8.8和20 ~ 37°C的环境范围内保持稳定的SOD模拟活性。通过比较广泛条件下的抑制率，Cu-TCPP- Mn纳米点表现出略高于Cu-TCPP的类SOD活性，这可能是由于获得的Mn-N活性位点赋予Cu-TCPP- Mn更高的类SOD活性。我们还通过另一种氧化还原指示剂——二氢乙啶(DHE)来评估Cu-TCPP-Mn的SOD模拟活性，DHE已被用作ROS检测的超氧化物探针。通过测量DHE 610 nm处的荧光信号，发现Cu-TCPP-Mn纳米酶单独产生了细微的超氧化物，而Cu-TCPP-Mn可以有效地清除黄嘌呤(X)和黄嘌呤氧化酶(XO)产生的氧自由基，验证了Cu-TCPP-Mn纳米酶具有优异的类sod活性。与Cu-TCPP-Mn纳米片结构相比，这些纳米点呈现出更高的分散性和更多暴露的活性位点，因为它们大小使它们更像天然酶。H2O2进一步被CAT催化生成H2O和O2。然后我们测试了 H2O2 的消耗和 O2 的产生，以验证 Cu-TCPP-Mn 纳米酶的 CAT 模拟活性。[Ru(dpp)3]2+Cl2检测表明Cu-TCPP-Mn可以显着消除H2O2，其催化活性优于Cu-TCPP。Cu-TCPP-Mn 的消除率具有浓度依赖性，其中较大量的 Cu-TCPP-Mn 可以显着加速 H2O2 的催化。此外，通过溶解氧的产生计算出的类CAT动力学证实了Cu-TCPP-Mn纳米酶具有优异的类CAT活性，可以将H2O2催化成水和O2。以H2O2为底物的Cu-TCPP-Mn的Km值比Cu-TCPP低4倍，而Cu-TCPP-Mn的Vmax和Kcat 显著高于Cu-TCPP，这表明Cu-TCPP-Mn具有更高的类CAT活性。Cu-TCPP-Mn (34.65 mM) 的表观亲和力与以过氧化氢为底物的天然过氧化氢酶 (25 mM) 相当，表明基于 MOF 的纳米酶是生物医学应用的理想催化剂候选者。还发现较高浓度的 Cu-TCPP-Mn 可以导致快速且更明显的氧气产生。当在不同pH值的缓冲液中孵育时，Cu-TCPP-Mn保持相对稳定的催化H2O2的速度，凸显了其优越的催化能力。总的来说，Cu-TCPP-Mn 双金属纳米酶在不同条件下表现出稳定的 SOD 和 CAT 样活性。探讨Cu-TCPP-Mn纳米酶的体外抗氧化酶样作用。将 100 μM H2O2 添加到 H9C2 细胞中，刺激细胞内 ROS，以模拟心肌缺血引起的氧化应激。流式细胞术检测Cu-TCPP-Mn处理组的细胞内ROS水平显着降低。使用LPS刺激的RAW 264.7细胞来测试Cu-TCPP-Mn的抗炎作用。激光扫描共焦荧光显微镜（LSCFM）在LPS处理（PBS）组中显示绿色荧光信号，这代表H2DCFH-DA探针染色的细胞内ROS升高。与LPS处理组相比，Cu-TCPP-Mn处理后荧光信号显着降低，验证了Cu-TCPP-Mn纳米酶有效的ROS清除能力。Cu-TCPP-Mn纳米酶的细胞内ROS清除作用通过荧光光谱法进一步验证。与共焦荧光图像的结果一致，与 PBS 组相比，Cu-TCPP-Mn 组的 ROS 水平降低。Cu-TCPP-Mn纳米酶具有免疫刺激作用，如巨噬细胞中免疫刺激因子表达增加所示。此外，我们还研究了 Cu-TCPP-Mn 的抗炎能力。 ELISA结果显示，Cu-TCPP-Mn处理后IL-1β和TNF-α的产生减少，IL-10相对较高，验证了Cu-TCPP-Mn可以显着抑制炎症反应。通过与 H2O2 共孵育以体外诱导 ROS 产生，在 H9C2（大鼠心肌细胞）和 bEnd.3（小鼠脑血管内皮）细胞系中测试了 Cu-TCPP-Mn 纳米酶针对 ROS 损伤的细胞保护特性。通过甲基噻唑基四唑 (MTT) 测定测试，Cu-TCPP-Mn 处理显着提高了细胞存活率。一致地，碘化丙啶（PI）凋亡染色的流式细胞术结果显示出 Cu-TCPP-Mn 纳米酶显着的细胞保护作用。通过MTT法研究了Cu-TCPP-Mn的细胞毒性，结果表明Cu-TCPP和Cu-TCPP-Mn在浓度低于50 μg/mL时在RAW264.7和bEnd.3细胞中均没有表现出明显的细胞毒性。 Cu-TCPP-Mn在1 μg/mL至1000 μg/mL不同浓度范围内的溶血率均低于1%，表明Cu-TCPP-Mn纳米酶在生物医学应用中的优势。
3、急性心肌梗死在发病早期常伴有强烈的炎症反应。缺血介导的ROS生成在激活缺血心肌的炎症信号，诱导细胞因子和趋化因子表达，促进白细胞整合素活化中起重要作用。受Cu-TCPP-Mn纳米酶体外清除ROS结果的启发，我们因此评估了Cu-TCPP-Mn纳米酶对急性心肌梗死小鼠模型的ROS清除和抗炎作用。采用冠状动脉左前降支永久性结扎法建立小鼠急性心肌梗死模型。心电图确认LAD结扎成功，并出现ST段抬高。通过小鼠尾静脉注射Cy5标记的Cu-TCPP-Mn纳米酶，评价Cu-TCPP-Mn的生物分布和心脏蓄积。注射后6 h和12 h，取心肌梗死组和假手术组的心脏和主要器官进行离体荧光成像。Cu-TCPP-Mn在给药后6和12 h在肝脏中明显保留。注射后6、12 h，心肌梗死组心脏荧光信号清晰。MI小鼠的心脏中积累了更多的Cu-TCPP-Mn纳米颗粒，这在很大程度上是由于缺血心脏炎症病变中的通透性和滞留性（EPR）增强。还通过ICP-AES检测了Cu-TCPP-Mn纳米酶在主要器官中的积累。假手术组和MI小鼠组肝脏中Cu-TCPP-Mn的归一化剂量分布最高（16.315±2.147%ID/g与16.312±1.021%ID/g）。具体而言，Cu-TCPP-Mn在MI心脏中的积累为8.062±1.378%ID/g，显著高于假手术组（4.435±0.453%ID/g）的积累。纳米酶对受伤心脏的炎症病变具有优先靶向作用[65-67]。然后，将MI小鼠模型随机分为4组（n=5），包括健康对照组（Sham）、用PBS处理的MI手术组（MI+PBS，200μL）、Cu-TCPP纳米酶（MI+Cu-TCPP，0.5mg/kg）和Cu-TCPP-Mn纳米酶（MI+Cu-TCPP-Mn，0.5mg/kg。MI手术后立即静脉注射PBS和纳米酶（第0天），然后在第2天第二次注射，在第3天第三次注射。最后一次注射后，DHE和DCFH-DA分别检测梗死心肌中ROS的产生。Cu-TCPP-Mn的处理显著降低了缺血心肌中ROS的产生。血清中乳酸脱氢酶（LDH）和乳酸脱氢酶-1（LDH-1）的浓度（反映缺血严重程度的主要生物标志物）在Cu-TCPP-Mn处理组中也有所降低。此外，还对梗死心肌3天后进行末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色，以评估心肌细胞的凋亡。MI手术导致心肌细胞凋亡增加。Cu-TCPP-Mn纳米酶处理3天后，TUNEL阳性心肌细胞的数量显著减少，这与细胞内发现Cu-TCPP-Mn通过清除ROS对H9C2心肌细胞和RAW264.7细胞具有保护作用相一致。氯化四氮唑（TTC）染色还显示，与PBS或Cu-TCPP组相比，给予Cu-TCPP-Mn后，梗死面积（白色染色区域，蓝色虚线）显著减小（p<0.05）（图4F）。这些结果表明，Cu-TCPP-Mn纳米酶可以改善心肌细胞的死亡。
4、急性心肌梗死诱导的病理损伤后，心肌细胞的损失和瘢痕的逐渐形成会损害心脏功能，甚至导致心力衰竭。为了进一步了解纳米酶对MI小鼠心脏功能和心脏重塑的长期保护作用，我们使用超声心动图在指定时间点监测MI手术后的心脏功能。在手术后第7天，MI手术导致心脏前/后壁变薄，并伴有收缩和舒张心脏功能障碍。Cu-TCPP-Mn治疗一周后，左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）、左室舒张内径（LVIDd）和左室收缩内径（LVID）均显著改善，治疗4周后恢复有效。Cu-TCPP处理可以在第7天暂时恢复EF和FS。但是，Cu-TCPP-Mn组（EF和FS测定）在第28天的心功能比Cu-TCP-P-Mn组差，表明Cu-TCP-Mn在治疗MI方面具有优越性。这些结果证实，Cu-TCPP-Mn纳米酶优于Cu-TCPP，不仅在急性期，而且在心功能的长期恢复方面具有可靠的保护作用。接下来，通过Masson三色染色进行组织学分析，以研究MI后的心脏重塑。PBS组可以很容易地观察到瘢痕组织（蓝色）在解剖心脏中的分布，而Cu TCPP和Cu TCPP-Mn处理组的瘢痕组织大小明显减小。与所有其他组相比，Cu-TCPP-Mn组显示出更少的纤维化和更好的心脏形态。以上结果表明，Cu-TCPP-Mn纳米酶处理后可改善心功能。还通过免疫荧光染色观察了MI 28天后纳米酶在心脏中的促血管生成作用。与其他组相比，Cu-TCPP-Mn组有效地促进了新生血管的形成，表现为分布在梗死边界区的CD31+和α-SMA+毛细血管数量增加。通过评估炎症细胞和炎症生物标志物的表达来确定Cu-TCPP-Mn的抗炎效果。与对照组相比，Cu-TCPP-Mn组中性粒细胞（CD45+）和巨噬细胞（CD68+）的浸润显著减少。此外，与其他组相比，Cu-TCPP-Mn组血清中IL-1β和TNF-α的促炎细胞因子明显降低，而由于Cu-TCPP-Mn的抗炎作用，血清中IL-10的抗炎细胞因子增加。我们分析了Cu-TCPP-Mn纳米酶在体内的长期毒性。治疗后28天处死小鼠进行生物相容性评估。采集包括肾、肝、脾和肺在内的主要器官，并用苏木精和伊红（H&E）染色。经治疗的小鼠未观察到明显的全身毒性。同时，测试了治疗28天后小鼠模型上主要肝肾损伤生物标志物的血液生化测定，包括丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、血尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）。不同组之间这些损伤生物标志物的差异可以忽略不计，这表明在给定剂量下Cu-TCPP-Mn纳米酶的生物安全性。总之，上述结果证明了Cu-TCPP-Mn纳米酶提供的抗ROS和抗氧化功能，导致其心肌保护作用。
5、缺血心肌的再灌注会诱导ROS的过量产生，导致心肌功能障碍。在这个项目中，我们进一步评估了Cu-TCPP-Mn纳米酶在心脏I/R损伤大鼠模型中的治疗效果。如示意图设计所示，通过在4周雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠中手术闭塞冠状动脉30分钟，然后再灌注24小时，建立大鼠模型。I/R损伤大鼠用PBS、Cu-TCPP或Cu-TCPP-Mn以1.0mg/kg的剂量连续给药三次。在第7天和第28天进行T微磁共振成像（MRI）扫描，以监测大鼠模型的心脏功能。当用Cu-TCPP-Mn治疗时，心肌功能显著恢复，从电影图像计算的EF增加证实了这一点。此外，Cu-TCPP-Mn纳米酶改善心肌纤维化，梗死面积从30.7%±5.76%减少到6.74%±2.69%。为了进一步探讨Cu-TCPP-Mn是否能促进心肌修复和心功能改善，我们用CD45、CD68和CD206对心脏组织进行了染色。IHC结果表明，Cu-TCPP-Mn具有一定的抗炎作用。此外，与其他组相比，经CD31、α-SMA染色的心脏组织在Cu-TCPP-Mn治疗后毛细血管密度明显增加，表明Cu-TCPP-Mn能够长期血管肌生成、心室重塑和心脏功能恢复。对I/R损伤大鼠主要器官进行组织学评价，以评价Cu-TCPP-Mn纳米酶的生物安全性。未观察到明显的组织坏死或不良事件，表明Cu-TCPP-Mn纳米酶具有令人满意的组织相容性。所有这些结果充分证实了CuTCPP-Mn纳米酶在治疗心脏I/R损伤方面具有很高的应用潜力。
7、作者给出结论
1、基于生物启发我们开发了一种双金属MOF纳米酶，以模拟级联SOD和CAT活性来消除ROS。它含有丰富的Cu活性位点和Mn活性位点，具有较高的催化效率。动力学分析和产氧速度分析表明，Cu-TCPP-Mn纳米酶具有良好的SOD和CAT活性。
2、体外实验表明，双金属MOF纳米酶具有良好的清除ROS活性和令人满意的生物相容性。
3、进一步建立了MI小鼠模型和心脏I/R损伤大鼠模型，以评估Cu-TCPP-Mn纳米酶在体内的抗ROS和抗炎能力。与单一金属MOF纳米酶相比，双金属MOF纳米酶在心脏损伤早期炎症阶段表现出优异的ROS清除和炎症抑制性能。此外，它还通过重塑心室结构、减少疤痕、促进血管平滑肌生成，最终改善心脏功能，显示出长期的心脏保护能力。
