NCB丨加州大学伯克利分校：机器学习增强过氧化物酶体能力使多酶途径区室化

植物利用不同组织区隔不同的代谢途径，为相应的化学反应提供最佳条件并防止不必要的交叉反应。在酵母中模仿植物组织反映特点实现细胞器区室化为微生物高效合成提供思路。过氧化物酶体存在于不同生物体中负责执行各项生化过程，它能够高密度隔离酶并防止内源交叉反应，同时可以保护细胞免受损害。酿酒酵母以葡萄糖为碳源生长时，过氧化物酶体非必需，因此可以对过氧化物酶体进行改造，将异源代谢途径定位于其中且不干扰内源反应。

传统发酵时，葡萄糖会抑制过氧化物酶体增殖（即过氧化物酶体数量和大小的扩增），从而限制过氧化物酶体作用。当酿酒酵母以油酸或其他长链脂肪酸作为唯一碳源生长时会诱导过氧化物酶体增殖，但含油酸培养基存在多种挑战，如水溶性差、生长缓慢等。同时，过氧化物酶体对异源蛋白的容量也是实现更高产量的关键限制因素。近年来，人工智能算法在优化输出方面表现出色，尤其是在免疫疗法、蛋白质工程和其他生物学领域，因此该研究转向机器学习（ML）增强遗传筛选。

工程化构建Erg20双隔间

香叶醇由香叶醇合酶利用香叶基二磷酸（GPP）生成，在酿酒酵母中GPP被转化为法尼基二磷酸（FPP），FPP在甾醇合成中起关键作用，对细胞的生存至关重要。Erg20p被认为是香叶醇生物合成的限制步骤，它有GPP合酶和FPP合酶双功能，由它产生的GPP会迅速转化为FPP，这导致胞内GPP浓度较低。为了积累GPP，作者使用FPP合酶活性较低的突变体Erg20p（Erg20p_MUT，F96W;N127W）生成GPP（图1a）。但用Erg20pMUT完全替代Erg20p会造成FPP不足以维持细胞生存，因此作者将Erg20pWT隔离在细胞质中，在过氧化物酶体内高度表达Erg20pMUT生成高浓度GPP库。Erg20p具有二聚体特性，于是作者在细胞质中合成了一个仅生成FPP的Erg20pWT同源二聚体提高生长速率并消除生长缺陷。这一改进成功构建Erg20双隔间，一个用于宿主细胞生长，另一个用于优化香叶醇生物合成途径。

图1 Erg20p_mut生产高浓度GPP以增加香叶醇产量

转录组分析与过氧化物酶体相关基因变化

作者通过转录组学分析比较工程化转录因子（Adr1c、Oaf1c和Pip2c）与野生型菌株，发现过氧化物酶体相关基因转录水平变化幅度较小。为了改造更高容量过氧化物酶体，作者分析所有差异基因，模拟自然条件下的过氧化物酶体增殖。结果显示大多基因与β-氧化相关，这些蛋白质可能不会同时控制过氧化物酶体的形态和增殖而使主要在酶体内催化脂肪酸β-氧化。

在所有与过氧化物酶体增殖和形态相关的基因（PEX）中，只有PEX11的转录变化大于0.53。

改变PEX11表达，改变过氧化物酶体形态，不影响功能容量

PEX11基因缺失会导致较少的且较大的酶体，它们可能在某些功能上存在缺陷，如以油酸为唯一碳源时生长较慢，并且酶体在母细胞向子细胞继承时表现出缺陷等。作者通过过表达或敲除PEX11时观察到了类似的剧烈形态变化（图2a），当带有荧光标记的过氧化物酶体膜的菌株中导入异源蛋白时，每个细胞的过氧化物酶体数量减少，这表明在导入大量蛋白质时酶体可能会聚集（图2b）。尽管这些菌株的过氧化物酶体形态不同，但Pex11p过表达略微降低了功能容量（图2c）。

在ΔPEX11菌株中，酶体数量较少但个体酶体较大，单个酶体可能能够隔离更多的蛋白质。然而，整个细胞群体中酶体分布不均，一些细胞可能只有一个较大的酶体，而其他细胞则没有酶体（图2）。形态和分布的变化并未改变酶体在整个细胞群体中隔离蛋白质的总量，与野生型菌株相比没有显著变化。

过表达过氧化物酶体相关复合物可增加容量

虽然即使单独改变了某些过氧化物酶体相关蛋白的形态没有显著提高功能容量，但许多相关蛋白质需要协同工作，因此作者测试了与酶体生物学相关的蛋白质复合物的过表达。结果显示酶体容量进一步提升，甚至超出了自然诱导容量水平。

单独过表达Pex11p不能增加酶体容量，但该基因在酶体增殖条件下是最强烈上调的PEX基因，增加过氧化物酶体的数量可以为导入复合物和其他膜蛋白的过表达提供更大的表面积。作者过表达了胞质受体Pex5p以及各个过氧化物酶体复合物（包括裂变（Pex11p）、膜蛋白插入和稳定（Pex3p、Pex8p和Pex19p）、转位（Pex13p、Pex14p和Pex17p）、反转位（Pex2p、Pex10p和Pex12p）以及回收（Pex1p、Pex4p、Pex6p、Pex15p和Pex22p）），结果表明单独过表达这些复合物仅导致较小的酶体容量增加。这表明即使是过表达某个功能复合物，功能容量的变化也并不大。当一起过表达所有这些酶体复合物时（称为理性工程化菌株），酶体容量显著增加，甚至超过了通过工程化转录因子诱导的自然容量。

图2 PEX11表达水平会影响过氧化物酶体的形态，但不改变过氧化物酶体的功能容量

机器学习进一步提升了过氧化物酶体的容量

首先作者实验测试了117个理性设计的菌株，其中，这些菌株过表达了25个与过氧化物酶体相关基因中各种组合，或敲除了6个被认为可能影响过氧化物酶体容量的基因，并将数据机器学习分析。作者使用CNN+LSTM和GBR筛选了整个组合库，以预测基因过表达组合对过氧化物酶体容量的最大影响。为了避免某些组合空间区域测试不足，作者利用基因共现矩阵生成未测试菌株的测试数据集，优先考虑共现频率较低的基因组合，从而促进了更均衡和广泛的组合输入空间。（图3a）。图3b展示了最终迭代线路中两种最佳机器学习模型（CNN+LSTM和GBR模型）的训练和测试结果。机器学习方法预测出的这些基因组合并非基于蛋白质功能的理性设计，这些蛋白质仅是不同过氧化物酶体复合物的亚集。作者将机器学习预测菌株称为增强容量的过氧化物酶体（EPC）菌株，增加了过氧化物酶体的容量和导入速率。该EPC菌株的功能容量分别比野生型菌株、工程化转录因子和理性设计菌株提高了137%、39%和21%。这一预测不仅减少了表达的蛋白质数量，还在理性设计的基础上进一步提升了酶体容量。在酿酒酵母中表达一个截短的去甲苯胺合酶（tNCS）是有毒的，而将该蛋白质定位到过氧化物酶体中可以缓解毒性。因此，进一步提高过氧化物酶体的容量和导入速率，可以在不影响宿主细胞活力的情况下实现更高的产量。当tNCS在EPC菌株中表达时，与野生型菌株和理性设计菌株相比，菌株的生长明显改善，这表明该菌株能有效隔离这些有毒蛋白（图3d）。与理性设计菌株相比，EPC菌株功能容量的提高（仅21%的增长）导致了酶体功能的显著差异。

图3 机器学习流程引导过氧化物酶体相关基因的过表达

增强容量的过氧化物酶体促进香叶醇合成

EPC菌株产香叶醇显著高于野生型菌株。作者在酿酒酵母中将异源、内源甲羟戊酸途径隔离到增强容量的过氧化物酶体中生物合成香叶醇，其中所有酶通过C端ePTS1标签定位。来自Enterococcus faecalis的MvaS和MvaE催化乙酰辅酶A到甲羟戊酸的转化，过表达酿酒酵母内源酶Erg12p、Erg8p、Mvd1p和Idi1p可以将其转化为异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），再由Erg20pMUT转化为GPP，最终来自Valeriana officinalis的截短版香叶醇合酶tVoGES将GPP转化为香叶醇。结果显示，EPC菌株24小时内香叶醇产量提高80%，达到957 mg/L（图4a）。EPC菌株还避免与胞质酶的竞争，实验表明，胞质中过表达竞争酶（如沉香合酶ADS）不会显著影响EPC菌株香叶醇产量，但会导致胞质ΔPEX5菌株产量下降（图4b）。此外，双隔间策略表现出稳定合成香叶醇的能力和细胞活力。通过补料分批实验，EPC菌株在5天内达到9.50 g/L的香叶醇产量（图4c），相比之前研究在30天内获得5.52 g/L的产量，生产效率提高了一个数量级。

图4 EPC菌株在减少胞质酶竞争的情况下持续稳定合成高滴度香叶醇