芹菜糖是一种天然戊糖。芹菜糖苷是广泛存在于植物界的具有生物活性的天然产物。目前已报道约1200个植物来源的芹菜糖苷，其中类黄酮芹菜糖苷占比最大，且在植物生长调控中发挥激素作用。目前芹菜糖苷主要从植物中提取和纯化获得，该过程费力且耗时。由于其结构特殊，化学合成芹菜糖基团步骤繁琐且不经济，需要使用昂贵的金属催化剂。芹菜糖苷的生物合成途径尚不清楚，芹菜糖基转移酶的催化机制亦不明确。因此，挖掘可识别催化芹菜糖的糖基转移酶对芹菜糖苷成分的研究与应用具有重要意义。
芹菜糖基转移酶GuApiGT的挖掘和表征
基于生物合成路径，作者用已知基因GuCHS和GuCHR为探针对乌拉尔甘草的根、皮质、叶片这三个部分的转录组进行了共表达分析，共得到289个相关系数>0.8的候选基因，其中MSTRG.23171.4在系统发育树中与ZjOGT3821和TcOGT422等类黄酮2″-O-糖基转移酶聚类，被认为是候选的芹菜糖基转移酶基因。随后作者通过异源表达MSTRG.23171.4，发现其可以高效催化（异）甘草苷生成芹菜糖（异）甘草苷，证实了MSTRG.23171.4是一种芹菜糖基转移酶，并命名为GuApiGT。这是自然界鉴定的第一个酚类芹菜糖基转移酶。
图1 甘草中芹菜糖基转移酶的生物信息学分析
图2 GuApiGT的功能表征
GuApiGT底物杂泛性
为了探索GuApiGT的催化混杂性，作者对65种底物进行了测试。LC/MS分析结果表明，GuApiGT具有较高的底物杂泛性和较高的催化效率。GuApiGT可高效催化黄酮7-O-糖苷、4′-O-糖苷、5-O-糖苷、6-C-糖苷、氧杂蒽酮C-糖苷、香豆素糖苷及松脂素糖苷等37种酚类底物，不能催化游离类黄酮以及三萜糖苷等底物。同时，作者对包括芹菜糖、木糖、阿拉伯糖等8种糖基供体选择性进行了测试。结果表明GuApiGT仅对芹菜糖表现出高度转移性，对其他糖基供体无活性。
图3 GuApiGT的底物混杂性测试
GuApiGT的芹菜糖基供体选择性机制研究
为了研究GuApiGT选择专一性的机制，作者解析得到分辨率为2.2Å的GuApiGT蛋白晶体结构。通过结构比对分析发现，GuApiGT在常规糖基转移酶的44个氨基酸构成的保守PSPG基序区域中有一个额外的S371残基。该区域由R368L369G370S371D372H373组成（RLGSDH基序），与其他糖基转移酶相比形成了更大的二级结构。由于S371的存在，整个区域柔性变强，可以通过π-π堆积或氢键作用稳定UDP-芹菜糖从而靠近糖受体而发生反应。而对于UDP-葡萄糖或UDP-木糖等都因其在活性口袋中的角度或距离而无法进行反应，并通过计算进行了理论验证。
图4 GuApiGT糖基供体选择性机制研究
对GuApiGT和Sb3GT1进行糖基供体选择性改造
为了验证上述RLGSDH基序对GuApiGT糖供体选择性的作用，作者进行了定点突变。首先删除了额外的S371，催化活性明显降低。同样的，对这个基序其他氨基酸都进行删除，催化活性均有所降低，证明RLGSDH基序确实是该酶催化的关键氨基酸。随后作者将其与葡萄糖基转移酶关键氨基酸进行对比，并进行点突变改造GuApiGT的供体选择性。L369/H373Q双突变体和I136T/G370/H373Q三突变体分别可以高效催化木糖糖基化及葡萄糖糖基化反应。
图5 GuApiGT突变体糖供体选择性的改变
随后，作者希望将其他糖基转移酶改造为芹菜糖基转移酶。同样基于RLGSDH基序比对，对已报道糖基转移酶Sb3GT1进行点突变，该酶可以催化除了芹菜糖以外的其他5种不同的糖基供体。将Sb3GT1对应的FFGDQ序列突变为FFGSDH，结果表明Sb3GT1也产生了芹菜糖基转移酶的活性。
图6 Sb3GT1突变体的芹菜糖基转移酶活性
关键RLGSDH基序是豆科植物中芹菜糖基转移酶的通用基序
为了挖掘更多的芹菜糖基转移酶，作者利用在线转录组数据库进行了大规模非靶向生物信息学分析，共发现来源于39种植物的121条芹菜糖基转移酶候选基因，其中来源于豆科植物候选基因的PSPG基序区域均含有45个氨基酸，故作者推测RLGSDH保守基序是豆科植物中芹菜糖基转移酶的通用基序。接下来作者从候选基因中选取了PtApiGT、SsApiGT、GiApiGT和GgApiGT进行了异源表达，功能表征结果显示这些候选基因均有芹菜糖基转移酶活性。
图7 豆科植物中芹菜糖基转移酶的挖掘
利用本氏烟草从头合成芹菜糖甘草苷及其类似物
作者在本氏烟草中重构了芹菜糖甘草苷及芹菜糖异甘草苷的从头合成途径。其分为黄酮苷元模块（AtPAL、AtC4H、At4CL、AtCHS、GuCHR、GuCHI），UDP供体模块（pgm、galU、CalS8、UAXS）及糖基转移酶模块（GuGT53、GuApiGT）。实现了本氏烟草从头合成5.46 mg/g的芹菜糖甘草苷和4.73 mg/g的芹菜糖异甘草苷，产量与甘草药材含量相当。最后，作者通过改变黄酮苷元模块的基因组合，实现了其它8种黄酮芹菜糖苷的从头合成。
图8 烟草中(异)芹菜糖甘草苷及其类似物的从头合成
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41467-023-42393-1
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摘译 |卢其圆
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
审核 | 刘 娟
