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前面我们给大家分享了基因组文件和基因组注释文件的下载（点击查看）。给大家分享了怎么用基因组文件构建索引，和用注释文件构建基因长度文件，和bam文件定量得到raw count和TPM文件（点击查看）。
但是最终的基因表达文件中有Raw count和TPM数据，但是没有基因的名字，只有ENSG。
今天，我们又给大家分享万能代码。一键从bam文件得到基因表达文件，含基因名，TPM表达量：
这样你就可以用这个表达矩阵做很多事情了，用Raw count进行DEseq2的差异分析，也可以用TPM的表达矩阵进行单基因GSEA分析预测基因的靶基因及功能。
万能代码如下：
#!/bin/bash# 加载必要的模块module load subreadmodule load multiqc# 定义目录和文件路径,公众号：科研部，都是万能代码，请关注WORK_DIR="改为你的工作目录"GTF_FILE="改为你的路径/gencode.v38.annotation.gtf"BAM_DIR="改为你的路径"OUTPUT_FILE="all.id.txt"GENE_LENGTH_FILE="改为你的路径/gene_lengths.txt"RAW_COUNTS_FILE="raw_counts.txt"TPM_COUNTS_FILE="tpm_counts.txt"COMBINED_OUTPUT_FILE="rawcount_TPM.txt"# 切换到工作目录cd $WORK_DIR# 使用 featureCounts 生成原始计数数据featureCounts -T 40 -t exon -g gene_id -a $GTF_FILE -o $OUTPUT_FILE $BAM_DIR/*.bam# 使用 multiqc 对定量结果进行质控multiqc $OUTPUT_FILE.summary# 提取原始计数数据，跳过前两行注释tail -n +3 $OUTPUT_FILE | cut -f1,7- > $RAW_COUNTS_FILE# 从GTF文件中提取gene_id和symbol信息awk -F'\t' '$3 == "gene"' $GTF_FILE | awk -F';' '{gid = ""; gname = "";for (i = 1; i <= NF; i++) {if ($i ~ /gene_id/) {split($i, arr, "\"");gid = arr[2];}if ($i ~ /gene_name/) {split($i, arr, "\"");gname = arr[2];}}if (gid != "" && gname != "") print gid "\t" gname;}' > gene_id_symbol.txt# 输出 gene_id_symbol.txt 文件的内容echo "gene_id_symbol.txt 文件内容："cat gene_id_symbol.txt# 计算TPM值的脚本python3 << EOFimport pandas as pd# 读取原始计数数据，指定列名raw_counts = pd.read_csv("$RAW_COUNTS_FILE", sep='\t', header=0, names=["gene_id", "count"])print("Raw counts file head:\n", raw_counts.head())# 读取基因长度和symbol数据gene_lengths = pd.read_csv("$GENE_LENGTH_FILE", sep='\t')print("Gene lengths file head:\n", gene_lengths.head())# 读取gene_id和symbol对应关系gene_id_symbol = pd.read_csv("gene_id_symbol.txt", sep='\t', header=None, names=["gene_id", "symbol"])print("Gene ID to symbol mapping head:\n", gene_id_symbol.head())# 转换gene_id列的数据类型，确保一致性raw_counts['gene_id'] = raw_counts['gene_id'].astype(str)gene_lengths['gene_id'] = gene_lengths['gene_id'].astype(str)gene_id_symbol['gene_id'] = gene_id_symbol['gene_id'].astype(str)# 检查gene_id_symbol中是否有缺失值print("Missing values in gene_id_symbol:\n", gene_id_symbol[gene_id_symbol.isna().any(axis=1)])# 合并基因长度和symbol到原始计数数据merged_data = pd.merge(raw_counts, gene_lengths, on='gene_id', how='inner')merged_data = pd.merge(merged_data, gene_id_symbol, on='gene_id', how='left')print("Merged data head:\n", merged_data.head())# 计算TPMdef calculate_tpm(df):df = df.copy()gene_lengths_kb = df['gene_length'] / 1000 # 转换为kbreads_per_kb = df['count'] / gene_lengths_kbper_million_scaling_factor = reads_per_kb.sum() / 1e6tpm = reads_per_kb / per_million_scaling_factorreturn tpm# 计算TPM值tpm_values = calculate_tpm(merged_data)tpm_df = pd.DataFrame({'gene_id': merged_data['gene_id'],'tpm': tpm_values})print("TPM values head:\n", tpm_df.head())# 保存TPM值tpm_df.to_csv("$TPM_COUNTS_FILE", sep='\t', index=False)# 读取TPM数据，指定列名tpm_counts = pd.read_csv("$TPM_COUNTS_FILE", sep='\t')print("TPM counts file head:\n", tpm_counts.head())# 转换TPM数据中的gene_id列的数据类型，确保一致性tpm_counts['gene_id'] = tpm_counts['gene_id'].astype(str)# 合并原始计数、TPM值和基因symbolmerged_counts = pd.merge(merged_data, tpm_counts, on='gene_id')print("Merged counts with symbol head:\n", merged_counts.head())# 保存合并后的文件，并确保gene_id、symbol、count和tpm列的顺序final_counts = merged_counts[['gene_id', 'symbol', 'count', 'tpm']]final_counts.to_csv("$COMBINED_OUTPUT_FILE", sep='\t', index=False)EOFecho "基因表达矩阵生成完毕，文件保存为 $COMBINED_OUTPUT_FILE"
脚本概述
以下是一个用于从BAM文件生成基因表达矩阵的脚本。该脚本利用了常用的生物信息学工具和编程语言（如subread和Python），通过以下步骤实现：
使用featureCounts从BAM文件计算原始计数（Raw count）。
使用GTF文件构建基因长度文件。
从GTF文件中提取基因名（symbol）信息。
计算每个基因的TPM（Transcripts Per Million）值。
将原始计数、TPM值和基因名合并到一个最终的基因表达矩阵文件中。
这个脚本不仅自动化了数据处理过程，还确保了数据的准确性和一致性，使研究人员能够专注于转录组数据的后续分析和解释。
最后生成文件，Rawcount_TPM内容如下：
好了，希望能帮到大家。
结果解析
通过这个脚本，你将得到一个包含基因名、Raw count和TPM值的基因表达矩阵文件。这个文件可以直接用于后续的生物统计学分析（如差异表达分析）和功能注释。具体来说，这个脚本实现了以下关键步骤：
原始计数数据生成：使用featureCounts从BAM文件计算每个基因的原始计数。
基因长度和基因名提取：从GTF文件中提取基因的长度信息和基因名（symbol）。
TPM值计算：根据原始计数和基因长度计算每个基因的TPM值，这是一种归一化方法，考虑了不同基因长度对表达量的影响。
数据合并和输出：将原始计数、TPM值和基因名合并到最终的基因表达矩阵文件中，并保存为指定格式的文本文件。
应用和进一步分析
得到基因表达矩阵后，你可以使用不同的生物信息学工具和统计学软件进行进一步分析，例如：
差异表达分析：使用DESeq2、edgeR等工具比较不同样本或条件下基因的表达水平差异。
功能富集分析：根据表达差异的基因进行GO分析、KEGG通路分析等，揭示生物过程中的功能变化和调控网络。
基因集富集分析：使用GSEA（基因集富集分析）等方法，探索基因在特定生物学过程或疾病中的相关性和功能。
这些分析不仅有助于理解基因在生物学过程中的功能和调控机制，还能为后续实验设计和临床应用提供重要的理论支持和指导。
结论
通过自动化的转录组数据处理流程，研究人员可以高效地从原始数据到最终的解释性结果，为基因功能研究和疾病机制探索提供强大的工具和支持。这种一键生成基因表达矩阵的方法不仅节省了时间和精力，还确保了数据处理的准确性和一致性，是当前转录组学研究不可或缺的重要步骤之一。
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