Green Chemistry丨天津大学元英进团队在酿酒酵母中利用木质素衍生物转化为高圣草酚

木质素是木质纤维素生物质的三大主要成分之一，也是自然界中最丰富的芳香资源。大部分工业木质素来源于制浆造纸工业和生物精炼厂。然而，它们通常被焚烧用于发电或被视为废物，这些做法既不环保也不具经济可行性。木质素可以衍生为多种芳香化合物，如对香豆酸和阿魏酸，这些化合物是用于生产高价值产品的极具吸引力的天然芳香原料。由于木质素的异质性，开发绿色、可持续的转化路径对于有效升级可再生木质素至关重要。近年来，木质素衍生物的生物转化为高价值芳香产品显示出巨大的潜力，有望促进木质素的可持续增值，并助力原子经济概念的发展。木质素衍生物（如对香豆酸和阿魏酸）是主要的可生物利用芳香单体，具有作为微生物合成芳香天然产物起始前体的潜力。以木质素衍生物为起始前体，不仅缓解了前体供应有限的问题，还简化了合成路径，从而实现更高效的生产过程。酿酒酵母是一种模式生物和极具前景的底盘菌株，利用合成生物学工具可以方便地构建异源生物合成途径。设计一种高效的酿酒酵母微生物细胞工厂，有望促进木质素衍生物向高圣草酚的生物转化，从而推动木质素的增值和高圣草酚的生产。

本研究在酿酒酵母CEN.PK 2-1D中，通过筛选和异源表达关键酶，首次构建了从两种重要木质素衍生物（对香豆酸和阿魏酸）到高圣草酚的生物合成途径。首先，作者将柚皮素的生物合成途径引入到CEN.PK 2-1D中，生成了菌株Yzsy001。PhCHS在强启动子PTEF1的控制下表达，Pc4CL和MsCHI则在PTPI1和PPGM1的控制下表达。通过将这三种酶的基因表达盒整合到CEN.PK 2-1D的YPRCdelta15位点中，成功地从对香豆酸中获得了0.037 mmol/L的柚皮素。其次，在Yzsy001中扩展了圣草酚的生物合成途径，生成了菌株Yzsy002。作者通过将AtF3′H和AtATR1表达盒整合到Yzsy001的YORWdelta22位点，成功获得了0.08 mmol/L的圣草酚，并且没有任何剩余的柚皮素。该工程策略进一步使得在Yzsy002中构建了高圣草酚的生物合成途径。OsROMT-9、CrOMT2和VvFAOMT分别被引入到Yzsy002中，生成了Yzsy003、Yzsy004和Yzsy005菌株。其中，携带OsROMT-9的Yzsy003成功地产生了最高浓度为0.017 mmol/L的高圣草酚。同时，作者在酿酒酵母中也构建了从阿魏酸合成高圣草酚的生物合成途径。Pc4Cl、HvChs2和HvChi的组合最终使得从阿魏酸中产生的高圣草酚浓度达到了0.04 mmol/L，产率为28.6%。因此，成功地在酿酒酵母中通过筛选和表达异源关键酶构建了从木质素衍生物合成高圣草酚的生物合成途径。这一成就使得高圣草酚的生产具有了与其他底物竞争的能力。

图1 木质素衍生物在CEN.PK2-1D中的高圣草酚生物合成

乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）和丙二酰辅酶A（Malonyl-CoA）是柚皮素生物合成的重要前体，同时也是酿酒酵母中脂肪酸和脂质合成不可或缺的代谢产物。为了提高Acetyl-CoA的供应，作者讲内源性的ACS1、ACS2和ACC1进行过表达。结果表明， Ynar002中ACC1的过表达显著提高了柚皮素的产量，增幅为11.0%。然而，过表达ACS1或ACS2可能由于影响细胞生长从而降低了柚皮素的生产。为了进一步增强乙酰辅酶A向丙二酰辅酶A的流动，Ynar002中分别敲除内源性的CIT2和MLS1，以防止乙酰辅酶A进入TCA循环。结果表明，在Yar005中敲除CIT2使柚皮素的产量达到0.045 mmol/L，比对照菌株Ynar002提高了11.0%。在Ynar006菌株中敲除MLS1几乎未改善细胞生长或柚皮素的产量。随后，作者用弱启动子PCHO1替换MLS1的启动子（Ynar007）；然而，Ynar007的细胞生长和槲皮素生产几乎没有改善。这些结果表明，即使MLS1的轻微扰动也可能对细胞生长造成严重影响。

为了进一步改善柚皮素合成的前体供应，酿酒酵母中去除了对对香豆酸的降解途径。在Ynar005中删除FDC1基因，得到菌株Ynar008，槲皮素的产量提高至0.051 mmol/L，提升了13.2%。然而，删除PAD1基因在Ynar008中的槲皮素产量几乎没有改善，这与之前的报告一致。研究发现，酿酒酵母的内源性酶烯酰还原酶Tsc13在对香豆酸的降解中起到了重要作用，具体表现为通过还原对香豆酰辅酶A来降解对香豆酸。TSC13是脂肪酸合成中的必需基因，通过用植物中TSC13的同源基因替代TSC13，能够补充Tsc13的必需功能并消除不良的副反应。在Ynar010中用来自Malus domestica的MdECR基因同源体替代TSC13后，柚皮素的产量提高至0.062 mmol/L。

进一步为了研究限速酶的作用，作者分别通过低拷贝质粒过表达了Pc4CL、PhCHS和MsCHI。过表达PhCHS使得Ynar012中的柚皮素产量达到了0.13 mmol/L，比Ynar010高出1.1倍。为了提高关键酶的活性并促进槲皮素生物合成的代谢通量，进行了蛋白工程，通过共柔性连接肽（GGGGS）n将Chs和Chi融合。构建了不同连接肽数目和融合方向的酶融合表达盒，并通过低拷贝质粒引入Ynar010菌株。其中，Ynar018中的Chi-(GGGGS)1-Chs酶融合体使柚皮素的产量达到了0.22 mmol/L，比未融合的菌株高出2.5倍。考虑到高槲皮素供应需要限速酶的稳定表达，接着将多个CHI-(GGGGS)1-CHS盒子整合到Ynar010的Ty3位点中。最终得到的菌株Ynar021的槲皮素产量达到了0.56 mmol/L，是Ynar001的14.7倍。随后，作者在Ynar021的YORWdelta22位点整合了AtF3′H和AtATR1的表达盒构建了一个圣草酚的合成菌株Yeri001。其中，所有的柚皮素都被转化为圣草酚，最终得到了0.75 mmol/L的圣草酚产量。随后，作者将多个OsROMT-9拷贝引入Yeri001的Ty1位点，得到的菌株Yher001成功地从木质素衍生物中获得了0.40 mmol/L的高圣草酚。

图2 柚皮素供应工程增强了高圣草酚的生产

甲基化的芳香天然产物具有更好的生物活性，而大多数木质素衍生物则为未甲基化的，辅因子SAM的低可用性可能会阻碍高圣草酚的合成效率。为了提高SAM的供给，作者分别通过过表达SAH1、ADO1、MET6和ScMET13-AtMTHFR加速酿酒酵母中SAM的甲基循环。结果显示，分别过表达这四个基因使得高圣草酚的产量显著提高了22.5%、32.5%、35.2%和45.0%。将这四个基因一起过表达，Yher006株的高圣草酚产量为0.78 mmol/L，比Yher001株提高了95.0%。

图3 工程化SAM生物合成与回收以提高高圣草酚的生产

甲基转移酶的催化效率较差通常会阻碍木质素衍生物转化为甲基化天然产物。将OsROMT-9表达盒拷贝转入Yeri001后，该菌株在72小时发酵后产出了0.25 mmol/L的高圣草酚，且剩余0.36 mmol/L的圣草酚，转化率为41.2%。作者推测OsRomt-9的催化效率不尽人意，限制了高圣草酚的完全转化。由于Romt-9的晶体结构尚未公开，因此作者通过同源建模获得了OsRomt-9与其配体SAM的复合物结构。为了确认酶-底物相互作用，进行分子对接分析。根据提供的标准和对接得分，作者筛选出了三种被认为更可靠的构象。根据所得的构象，选择了活性位点Asn135、Ile324和Asn329作为潜在的突变位点。为了预测与底物有更好亲和力的变体，分别在这三个位点上进行了虚拟氨基酸饱和突变。作者通过筛选和验证突变后结果中的突变能量，找到了提高底物和酶亲和力的点突变。对Asn135进行突变后，突变体Romt-9N135T的底物转化率达到了62.6%，比Romt-9WT高出51.9%。随后，突变体Romt-9N135T被用作Ile324突变的模板，突变体Romt-9N135T/I324M的底物转化率达到了77.6%，比Romt-9WT高出89.3%。然而，基于Romt-9N135T/I324M对Asn329的突变几乎没有提高底物转化率

为了更好地理解突变体高催化性能的分子机制，作者进行了Romt-9^WT-圣草酚和具有最高对接得分的Romt-9^mut-圣草酚的对接结果的二维相互作用分析。结果表明，底物与活性口袋内的氨基酸残基之间形成了强的氢键，从而有助于复合物构象的稳定。与Romt-9^WT-圣草酚的结合口袋相比，Romt-9^mut-圣草酚的结合口袋表现出更多的疏水相互作用。此外，为了深入了解相互作用的能量方面，作者进行了分子动力学（MD）模拟，以研究酶-底物相互作用的动态机制。Romt-9^WT-圣草酚和Romt-9^mut-圣草酚复合物的均方根偏差（RMSD）达到平衡。结果表明，模拟过程已经稳定，酶与底物的结合是合理且稳定的。发现Romt-9^N135T/I324M-圣草酚的RMSD比Romt-9WT-圣草酚的RMSD高，表明底物诱导了酶的某些结构破坏。然而，一旦系统达到稳态，波动最终稳定下来，表明酶与底物之间的结合强烈且稳定。此外，还注意到，二次突变引起的结合口袋改变可能会影响底物与酶之间的相互作用。基于二维相互作用分析，这一变化实际上导致底物与改造酶之间的相互作用更强，从而可能促进催化反应。此外，作者还使用MM/GBSA方法计算了Romt-9^WT-圣草酚、Romt-9^N135T-圣草酚和Romt-9^N135T/I324M-圣草酚的结合自由能值，分别为−67.38 kcal/mol、−72.89 kcal/mol和−79.77 kcal/mol。最终作者得出结论，Asn135和Asn329是参与底物结合的接触残基，而Ile324是与结合口袋紧密相邻的辅助残基。结果强调了计算辅助酶改造策略在提高限速酶催化效率方面的潜力。

图4 合理设计和改造O-甲基转移酶以促进高圣草酚的生产

为了提高高圣草酚的生物合成性能，ROMT-9^WT被替换为ROMT-9^N135T/I324M，构建了菌株Yher007。该菌株在摇瓶发酵中获得了最高的高圣草酚滴度，达到1.0 mmol/L，产量为65.8%。为了评估这个优化细胞工厂的能力，作者在5-L生物反应器中进行了Yher007的补料批次发酵。补料批次策略首先使用葡萄糖作为碳源促进细胞生长。当OD₆₀₀达到15时，每12小时向生物反应器中加入浓缩的对香豆酸溶液（25 g/L）以促进高圣草酚的生物合成。这种两阶段发酵策略使得使用工程菌株Yher007从15.2 mmol/L对香豆酸中生产出3.2 mmol/L高圣草酚，且在补料批次发酵过程中，几乎没有中间体积累。

图5 通过组合策略实现木质素衍生物高效转化为高圣草酚