植物病害每年引发巨额经济损失，并对全球粮食安全和农业可持续性构成威胁。通过育种手段提高作物对病原体的抵抗力，是解决这一问题的核心策略。然而，这一改良的基石在于深入探究与理解植物复杂的免疫调控机制。
植物的免疫系统通过识别病原微生物而激活免疫反应，主要包含两道防线。第一层免疫防线PTI由病原微生物表面的病原相关分子模式（如多糖、鞭毛蛋白等）刺激诱导，可导致植物产生非特异性的防卫反应，具有快速、非特异性的特点。第二层免疫防线由植物的抗病蛋白识别病原微生物产生的效应蛋白引发，可使植物产生特异性的防卫反应，具有更强大、更特异性的特点。PTI和ETI之间的协同作用是植物免疫系统的重要组成部分，它们共同为植物提供强大而持久的免疫保护。
已发表的多篇植物抗病机制研究中都指出了植物的免疫相关基因表达具有细胞类型特异性[1-4]，例如针对拟南芥叶片真菌感染免疫应答机制的研究中（Cell host & microbe，20.6），研究者阐述了细胞内免疫受体NLRs表现出细胞类型特异性的表达模式。
接下来，小格将带您深入探索植物抗病机制研究领域中的单细胞研究策略~
01.
研究目标
针对某病原处理植物开展单细胞转录组测序（snRNA-seq）和单细胞染色质开放性测序（snATAC-seq），基于多组学技术构建细胞图谱的同时，深入解析细胞类型特异性的免疫应答网络。
02.
技术路线
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03.
项目流程
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实验方案
1
样本选择
（1）选取不同处理强度 / 不同处理时间 / 不同品种样本组织
（2）建议每组样本生物学重复 ≥ 3个
（3）根尖、茎尖等微量样本可以取多个单株混样为1个生物学重复
2
取样操作
选取生长状态良好，相对幼嫩的植物组织，放入盛有预冷ddH₂O的培养皿中，反复润洗以去除组织表面的泥土等杂质擦干组织表面液体，迅速放入预冷的冻存管中，立即液氮速冻 15min 以上，随后-80℃保存。
3
运输要求
干冰寄送，48小时内送达。
4
平台选择
按照预算选10xGenomics、DNBelabC-TaiM4单细胞平台均可：同一细胞核RNA+ATAC需选择10xGenomics；一份细胞核一分为二需选择DNBelabC-TaiM4。
5
取样量推荐
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重点分析内容
5.1.细胞分群与注释 —— 构建细胞图谱
细胞分群与注释是非模式植物单细胞项目中非常重要的一环。
多样本整合分群：对于涉及到多个样本的项目，我们将所有样本数据整合进行细胞分群聚类。采用UMAP和tSNE两种降维方式展示。
细胞注释：对于大部分非模式植物还缺乏系统的marker基因用于细胞鉴定，因此需综合使用多种方法进行细胞注释。
5.2.明确细胞比例/表达模式变化、差异表达基因 —— 初筛关键细胞类型
与bulk RNA-seq相比，单细胞转录组可以将组间比较维度上升至各个细胞类型。可以先进行基于各细胞类型维度的单细胞基础分析，例如：细胞比例鉴定、细胞表达相关性变化、差异表达基因鉴定、差异表达基因功能富集分析等，初步筛选后续要重点分析的细胞类型。
5.3.拟时序分析 —— 明确细胞转化分化过程
拟时序分析基于基因表达，将细胞按照假定的发育轨迹（拟时序）进行排列，明确细胞转化分化过程。一般选取几个或几个细胞类群进行分析。
拟时序分析的数据挖掘主要分为以下2个思路
思路1：明确基因表达随拟时间的变化
对轨迹上具有相似表达趋势的基因进行分组，通过富集分析，明确不同功能基因表达随时间的变化模式。
思路2：发育轨迹分支点分析
分支点代表细胞开始产生程序性变化，对分支相关的差异基因进行分析，明确调控不同发育方向的关键基因。
5.4.WGCNA分析——筛选表达模式相似的基因，并探究其互作关系
WGCNA，全称为weighted gene co-expression network analysis，即权重基因共表达网络分析，主要可以解决比较组合多，关键差异表达基因难筛选的难题。
对于bulk RNA-seq，设置多个比较组合会产生许多组间差异表达基因数据，直接筛选关键基因难度大。当样本数≥20个时，可通过WGCNA分析建立基因共表达模块。
对于单细胞RNA-seq，分析可由个体深入到细胞类型。即，筛选在某些细胞类型中特异性高表达的共表达模块，然后在这个模块中挑选关键基因，构建关键基因的互作网络。
5.5.SCENIC分析——构建“转录因子+靶基因”调控网络
SECNIC分析旨在构建“转录因子+靶基因”的调控网络，转录因子的结合又可以通过单细胞ATAC-seq数据中提供的转录因子结合位点（Motif）结果互相验证。
5.6.细胞通讯分析——明确病原入侵后，各细胞类型间的信号传导机制
当病原入侵植物时，植物体内会启动一系列信号传导，这一过程涉及到大量的细胞间通讯。单细胞转录组可以获得不同细胞类型中配体和受体基因表达信息，基于PlantPhoneDB数据库可推断植物不同细胞间的相互作用。
06.
总结
植物抗病课题研究可设置不同处理时间、不同处理浓度、不同品种等多个比较组合。推荐生物学重复 ≥ 3个。
研究目标通常为构建细胞图谱以及细胞类型特异性的免疫应答调控网络。更推荐转录组+染色质开放性多组学策略。
细胞注释为非模式植物单细胞项目的关键环节，需要花费较多的时间精力，为后续分析奠定坚实基础。
数据挖掘可以基于某一细胞类型，涉及差异分析、拟时序分析、WGCNA分析、SCENIC分析、细胞通讯分析等。
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参考文献
[1] Tang B , Feng L , Hulin M T ,et al.Cell-type-specific responses to fungal infection in plants revealed by single-cell transcriptomics[J].Cell Host & Microbe, 2023(10):31.DOI:10.1016/j.chom.2023.08.019.
[2] Cao Y , Ma J , Han S ,et al.Single-cell RNA sequencing profiles reveal cell type-specific transcriptional regulation networks conditioning fungal invasion in maize roots.[J].Plant biotechnology journal, 2023.DOI:10.1111/pbi.14097.
[3] [1] Liu Z , Yang J ,Long, YanpingZhang, ChiWang, DapengZhang, XiaoweiDong, WentaoZhao, LiLiu, ChengwuZhai, JixianWang, Ertao.Single-nucleus transcriptomes reveal spatiotemporal symbiotic perception and early response in Medicago[J].Nature Plants, 2023, 9(10):1734-+.
[4] Liang X , Ma Z , Ke Y ,et al.Single‐cell transcriptomic analyses reveal cellular and molecular patterns of rubber tree response to early powdery mildew infection[J].Plant, Cell & Environment, 2023.DOI:10.1111/pce.14585.
