奇数脂肪酸（FAs）及其衍生物被用于各种应用，例如农用化学品、工业化学品、香料和香料中间体以及药品的前体。如壬酸（C9:0）已被用作治疗真菌感染的抗真菌剂，三庚酸酯形式存在的庚酸（C7:0）已被用于治疗遗传性代谢紊乱。虽然奇数中链脂肪酸（OMFAs）应用广泛，但天然脂肪酸主要以偶数长链脂肪酸（ELFAs）的形式存在。目前，OMFAs的商业化生产主要是通过在高温高压等恶劣条件下或与有毒试剂进行化学反应来实现的，这可能导致环境和可持续性问题。代谢工程与合成生物学已被用于设计微生物细胞工厂，以实现脂质化合物的高效生物合成，但OMFAs的从头生物合成很少有报道。
在工程酵母种从头合成蓖麻油酸
为在酿酒酵母中产生游离蓖麻油酸（RA），作者以产生游离脂肪酸的酵母YJZ45为出发菌株，分别引入三种编码油酸12-羟化酶的基因：CpFAH12（from Claviceps purpurea）、EfFAH12（from Epichloe festucae Fl1）、MaFAH12（from Metarhizium anisopliae），产生菌株GL2-GL4。其中，仅菌株GL2产生24.46 mg/L游离RA。随后，作者通过表达哺乳动物延长酶编码基因rELO2和内源性delta-9脂肪酸去饱和酶编码基因OLE1来改善油酸的供应。在菌株GL2中过表达rELO2和OLE1，获得菌株GL8，但其游离RA产量降至19.4 mg/L。作者推测，RA的产生可能受到磷脂酰胆碱酯化油酸的有限形成或含RA的磷脂酰胆碱的低水解的影响。接下来，为了增强油酸12-羟化酶的活性，在菌株GL2中表达玻璃体振荡菌血红蛋白基因VHb（该基因编码蛋白可以加强细胞的氧补充），获得菌株GL9，其游离RA的滴度增加到28.63 mg/L，较菌株GL2提高了17.0%。此外，为了提高CpFAH12和VHb表达水平，将其在高拷贝数质粒上表达，产生菌株GL10，但菌株GL10中游离RA的产量未增加。
在工程菌株中从头合成10-羟基硬脂酸
内源性油酸在油酸水合酶的作用下可产生10-羟基硬脂酸（10-HAS），然后通过臭氧分解裂解形成相应的OMFAs。作者以产生游离脂肪酸的酵母YJZ45为出发菌株，分别引入六种油酸水合酶：LfFah10（from Lysinibacillus fusiformis）、SmFah10（from Stenotrophomonas maltophilia）、EmFah10（from Elizabethkingia meningoseptica）、SnFah10（from Stenotrophomonas nitritireducens）、PaFah10（from Paracoccus aminophilus）、BbFah10（from Beauveria bassiana），获得菌株GL11-GL16。其中，菌株GL13的10-HSA产量最高，约6.0 mg/L。
油酸水合酶是一种黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖性酶，FAD被认为参与酶的稳定或油酸在活性位点的定位。因此，作者在菌株GL13中分别过表达编码核黄素激酶的FMN1基因和编码FAD合成酶的FAD1基因，获得菌株GL18和GL19。与菌株GL13相比，菌株GL18的10-HAS产量未显著提高，但菌株GL19的10-HAS产量增加了77.4%，表明强化FAD辅因子的供应是提高10-HSA产生的有效策略。为了评估关键酶表达增加的效果，作者尝试在高拷贝载体中表达基因EmFAH10和FAD1，获得菌株GL20，其10-HAS产量显着增加到32.05 mg/L，比菌株GL13高5.36倍。
图1. 油酸12-羟化酶和水合酶的生化特性
通过整合HFAs生产和裂解途径从头合成OMFAs
作者在能产生RA的工程菌株GL9和10-HAS工程菌株GL20中引入羟化脂肪酸（HFAs）裂解途径来合成OMFAs。HFAs裂解通路首先在长链次级醇脱氢酶（ADH）的作用下，将HFAs转化为酮脂肪酸。随后，BVMO将酮脂肪酸转化为酯。最后，脂肪酶（ERA）将酯水解成OMFAs。编码MlADH（from Micrococcus luteus）、PpBVMO（from Pseudomonas putida）和PfERA（from Pseudomonas fluorescens）的基因被整合到菌株GL9和GL20的基因组中，分别产生菌株GL22和GL23。
在菌株GL22中，RA通过MlADH转化为12-酮油酸（12-KOA），然后通过关键酶PpBVMO将12-KOA转化为11-庚氧基-十一-9-烯酸。最后，在PfERA水解活性的催化下，将11-庚氧基-十一-9-烯酸转化为C7:0和ω-OH-C11。发酵结束时，C7：0和ω-OH-C11的浓度分别为1.72 mg/L和2.98 mg/L。同时，还有14.38 mg/L RA和9.22 mg/L 12-KOA的积累，最终OD600为2.70。
在菌株GL23中，10-HSA被MlADH转化为10-酮硬脂酸（10-KSA），然后通过关键酶PpBVMO将10-KSA转化为9-（壬酰氧基）-壬酸。最后，在PfERA的水解活性催化下，将9-（壬酰氧基）-壬酸转化为C9：0和ω-OH-C9。发酵结束时，C9：0和ω-OH-C9的浓度分别为1.52 mg/L和2.16 mg/L。同时，积累了21.56 mg/L 10-HSA和12.88 mg/L 10-KSA，最终OD600为2.58。
图2. 酿酒酵母中葡萄糖从头生物合成OMFAs
使用活性更高的BVMO提高OMFAs产量
菌株GL22和GL23中12-KOA和10-KSA中间体积累较多，作者推测PpBVMO的低催化活性可能是两种途径中的限速步骤。以恶臭假单胞菌KT2440的PpBVMO序列作为模板使用BLAST进行基因挖掘，选择了12种对线性长链酮酸可能具有催化活性的BVMOs。BVMO蛋白在大肠杆菌中表达，并通过标准镍亲和层析纯化至均匀性，以10-KSA作为BVMO活性测定的模型底物。经实验发现，Af2BVMO具有高区域选择性（90:10），且转化率高达91.69%。表明Af2BVMO可以更有效地将10-KSA转化为酯。因此，作者选择Af2BVMO来催化OMFAs产生途径。
将编码MlADH、Af2BVMO和PfERA的三个基因分别整合到菌株GL9和GL20的基因组中，产量菌株GL24和GL25。菌株GL24产生7.83 mg/L C7:0和9.68 mg/L ω-OH-C11。与菌株GL22相比，分别提高了4.55倍和3.31倍。菌株GL25产生9.43 mg/L C9：0和13.48 mg/L ω-OH-C9。与菌株GL23相比，分别提高了6.20倍和6.24 倍。以上结果表明，Af2BVMO的表达是所开发的FA裂解途径中生产OMFAs的最佳选择。
图3. BVMOs的生化特性
图4. 酿酒酵母BVMO途径优化对OMFAs产量的影响
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.ymben.2024.01.009
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摘译 | 谭新佳
编辑 | 王咏桐
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