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CRISPR/Cas9基因编辑技术可快速、精确地创制基因组变异，在作物遗传改良方面具有巨大应用前景。尽管CRISPR/Cas分子工具只需暂时存在于植物细胞中即可引发所需的靶向遗传修饰，但传统的植物基因编辑方法通常采用稳定整合的转基因来表达核酸酶分子。分离去除外源转基因是基因编辑作物田间性状评估、中间试验和商业化应用的前提条件。虽然转基因可以通过自交或回交等手段从基因编辑植物中分离，但该过程依然费时费力，尤其是当编辑多倍体植物或多个靶基因时，多基因编辑效率低或基因连锁等问题常常使得分离鉴定无转基因的纯合突变体植物变得更加困难和耗时。因此，开发高效、无外源DNA的CRISPR/Cas基因编辑方法有望大大加快基因编辑作物育种进程。近日，云南省中烟工业有限公司技术中心和浙江大学农业与生物技术学院李正和教授团队联合在aBIOTECH 发表了题为“Development of an RNA virus vector for non-transgenic genome editing in tobacco and generation of Berberine Bridge Enzyme-Like mutants with reduced nicotine content” 的研究论文。在该研究中，作者首先利用一种负义RNA弹状病毒载体递送完整的CRISPR/Cas9核酸酶，开发了一种非转基因的烟草基因组编辑方法；利用该方法产生了大量无转基因、纯合的小檗碱桥接酶（BBL）基因家族突变体组合，并鉴定出尼古丁含量显著降低的烟草品系，为烤烟品种的定向改良提供了技术支撑和育种材料。
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作者首先通过改造一种负义RNA弹状病毒茄斑驳矮化病毒（eggplant mottled dwarf virus, EMDV）载体，通过病毒载体侵染的方法向烟草植株递送CRISPR/Cas9核酸酶，进而以病毒系统侵染的组织为外植体，经组织培养高效获得了烟草突变体植株，并证明了基因编辑产生的突变可以稳定地遗传至后代（图1）。该方法无需依赖稳定遗传转化材料，编辑植株不含有外源DNA。该载体是继李正和团队前期发展的苦苣菜黄网病毒载体之后（Ma et al., Nat Plants, 2020）又一种可以递送完整CRISPR/Cas9的植物弹状病毒载体，表明了该类病毒载体普遍具有强大的外源基因承载能力。
尼古丁俗称烟碱，是烟草中的主要致瘾化合物。为了减少吸烟成瘾导致的公共健康挑战，世界卫生组织建议将卷烟中的尼古丁含量强制性降低至0.4 mg/g的非成瘾水平，大约相当于当前含量的5%。烟草种质资源库中的常规品种均无法达到这一目标，而生物技术手段为低尼古丁烟草品系的创制提供了一种可能的途径。烟碱是一个具有吡啶和吡咯的双环化合物，在其生物合成通路的最后步骤中，小檗碱桥接酶（BBL）参与吡啶环（烟酸）与吡咯烷环（N-甲基吡咯烷正离子）的偶联反应。烟草基因组含有六个BBL基因家族成员(BBLa, BBLb, BBLc, BBLd1, BBLd2和BBLe)，在该研究中，作者利用EMDV介导的基因编辑方法在烟草主栽品种“红大大金元”中产生了16种BBL纯合突变组合。气相质谱法分析烟草生物碱含量显示，5种包含bbla和bblb的纯合突变株系(bbla/b/c/d1/d2/e, bbla/b/d1/d2/e, bbla/b/d1/e, bbla/b/d2/e和bbla/b/e)中尼古丁水平（0.27－0.40 mg/g）比野生型对照植株（5.8 mg/g）降低了14－22倍，且伴随新烟草碱和可替宁生物碱水平的显著降低（图2）。![]()
图2 烟草BBL突变体植株生物碱含量分析由于这些基因编辑株系不含有外源DNA，这为突变体在温室和试验田中的农业性状评估提供了很大的便利。试验表明，其中两个低尼古丁株系bbla/b/d1/d2/e和bbla/b/e在株高、叶片长度和叶片宽度等生物量指标方面与野生型植株无显著差异（图3），为低尼古丁烟草的培育提供了有价值的遗传材料。该研究展示了利用病毒介导的无DNA基因编辑技术进行多倍体植物、多基因编辑时的效用，以及在作物形状改良应用中具有的时间和成本优势。![]()
图3 烟草BBL突变体植株农艺性状评估
该研究得到了浙江省自然科学基金重点项目、中国烟草总公司重大专项以及云南中烟科技计划等项目的资助。云南中烟工业有限公司技术中心向海英博士、浙江大学研究生陈斌焕和王硕为本文的共同第一作者，云南中烟工业有限公司技术中心高茜博士和浙江大学李正和教授为本文共同通讯作者。
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