质粒作为媒介调控外源基因表达已被广泛用于重组蛋白和高价值产物合成，在经济和科学领域具有重要意义。在无筛选压力的情况下，当携带质粒菌株负担超过其带来的益处时，不携带质粒的菌株更具有竞争优势，此时菌株选择将质粒丢失。因此，通常使用额外的筛选压力确保质粒稳定复制和传递，如抗生素抗性基因等，但这也增加了抗生素抗性问题及额外的成本，同时抗生素被代谢时可能会引起质粒的不稳定。因此，质粒介导的无抗生素发酵具有重要的工业潜力。
目前，B. subtilis 168基因组中有15%的基因尚未被表征，E. coli MG1655中有34.6%的基因缺乏完整的实验证据来确认其功能。因此，探索大肠杆菌和枯草芽孢杆菌基因组中与质粒稳定性相关的基因非常重要。揭示这些基因元件将为质粒稳定性的机制提供宝贵的见解，并促进质粒稳定菌株的理性设计，从而推动工业应用的精准高效发展。
设计原理
质粒维持的机制主要包括位点特异性重组系统（SSRs）、主动分配过程和质粒成瘾系统。作者为进一步研究质粒稳定性的机制，探索了大肠杆菌中与这三种机制相关的潜在基因，例如，recA、recB和recC是参与DNA重组和修复的基因，dnaA、dnaB和dnaC是参与DNA复制启动和调控的基因，而ftsA、ftsZ和ftsQ则与细胞分裂和细胞壁合成相关。在这些基因中，DNA修复和DNA拓扑相关基因主要影响质粒的结构稳定性，细胞分裂相关基因主要影响质粒的分离稳定性，而DNA复制相关基因则影响质粒拷贝数。
作者通过检索STRING数据库构建了这些基因的互作网络。距离较近的蛋白质被推测具有较高的相互作用程度。整个蛋白质图中存在的高度交叉提示质粒维持机制的复杂性，枯草芽孢杆菌中也获得了类似的结果，这暗示着质粒稳定性与宿主细胞中许多基因密切相关，理性设计单个基因可能无法有效提高质粒稳定性。
图1 大肠杆菌中参与质粒维持的基因翻译的蛋白质相互作用网络
大肠杆菌质粒稳定底盘的筛选
为研究宿主细胞对质粒稳定性的影响，作者将质粒pGYJ-1转入五个不同的大肠杆菌菌株中，并计算质粒保留频率（PRF）。初期，DH5α和MG1655中的pGYJ-1质粒保留频率最高，分别达到89.23%和90.33%。在三次连续转移后，所有测试菌株中质粒连续丢失，特别是在BL21（DE3）菌株中。因此，不同宿主细胞中的质粒维持具有明显差异，可能是由于基因元件的差异。
作者利用MG1655基因组片段缺失文库（该文库覆盖了62.4%的非必需基因）进一步对有利菌株的高通量筛选。将质粒pGYJ-2分别转化到58个缺失菌株中添加卡那霉素进行培育，后转至无抗培养基中并记录sfGFP/OD600值。随着转移次数的增加，野生型菌株及大多数缺失菌株的sfGFP/OD600值显著下降。然而， EcΔ8、EcΔ50、EcΔ52、EcΔ54和EcΔ55表现出较高的sfGFP/OD600，显示出在质粒维持方面的巨大潜力。
作者后续计算这五个菌株质粒保留频率，结果显示， EcΔ50表现出最高的质粒稳定性。在第三次转移后，EcΔ50的质粒保留频率保持在90%以上，而MG1655菌株的质粒保留频率仅为57%左右。这些结果与pGYJ-2质粒在这些菌株中的荧光下降趋势一致，表明EcΔ50适合作为小质粒和大质粒的质粒稳定底盘。
图2 从大肠杆菌MG1655基因组片段缺失文库中筛选质粒稳定性高的菌株
EcΔ50底盘质粒稳定性改善的潜在机制
作者比较了EcΔ50和MG1655中的平均质粒拷贝数（PCN）。经过三次转移后， EcΔ50菌株中平均质粒拷贝数的下降率为69.23%，远低于MG1655的93.87%，表明EcΔ50中质粒稳定性得到增强。
后者作者分别对MG1655和EcΔ50菌株进行生长曲线分析。带有pGYJ-2质粒的MG1655菌株的生长显著受到质粒负担的抑制，而EcΔ50菌株在携带质粒的情况下生长仅受到轻微影响。作者推测EcΔ50菌株在无抗生素条件下表现出高质粒拷贝数和增强的质粒稳定性，从而在质粒维持方面具有显著优势。
为了进一步研究对质粒维持能力起关键作用的基因元素，作者从野生型菌株中逐步敲除相应片段，构建了EcΔ50-1、EcΔ50-1-2、EcΔ50-1-2-3和EcΔ50-1-2-3-4。野生型菌株和EcΔ50作为对照，通过基于荧光的系统评估了这些菌株的质粒维持能力。在每次转移过程中，新构建的EcΔ50-1-2-3-4菌株表现出的荧光水平与EcΔ50相当，表明EcΔ50的性能是由于特定片段的敲除而非其他位点突变导致的。EcΔ50-1-2-3在三次转移过程中也表现出显著高于野生型菌株和其他片段敲除菌株的荧光水平。这表明片段3和片段4中的某些基因与片段1和片段2中的基因共同作用，对EcΔ50的质粒维持能力起着关键作用。
图3 EcΔ50片段缺失菌株的荧光测定
EcΔ50底盘在无抗生素条件下合成应用
目前，化学品的稳定发酵主要依赖于抗生素的添加。在大规模生产中，随着无抗生素发酵时间的延长质粒会逐渐丢失，从而导致产量下降。为了解决这个问题，作者评估了质粒稳定菌株在无抗生素发酵中的潜力。以广泛应用于食品和医药领域的L-丙氨酸为例，构建了一个过表达alaD基因的质粒pGYJ-4，并分别将其转化到EcΔ50和MG1655底盘中。EcΔ50-1-2-3和EcΔ50-1-2-3-4菌株的生产水平与EcΔ50相当，优于其他变体。这些结果表明，基因组片段缺失菌株EcΔ50和EcΔ50-1-2-3在化学生产中具有优势。在无抗生素丙氨酸发酵中，EcΔ50菌株中pGYJ-4的拷贝数高于野生型，进一步证实了EcΔ50菌株的质粒维持能力较高。作者利用EcΔ50合成异丁醇，产量比MG1655菌株提高了10%。总体而言， EcΔ50在无抗生素条件下进行化学生产具有巨大潜力。
图4 大肠杆菌菌株EcΔ50在无抗生素条件下发酵合成L-丙氨酸的应用
B. subtilis 168质粒稳定底盘鉴定
在之前的研究中，作者筛选出了两个枯草芽孢杆菌质粒稳定性提高底盘BsΔ28和BsΔ44，作者对其进行分段敲除实验鉴定具体基因元素。结果表明，yoyB和yueB是BsΔ28和BsΔ44质粒维持能力提高的潜在靶标。
图5 从枯草芽孢杆菌基因组片段缺失文库中筛选质粒稳定性高的菌株
利用枯草芽孢杆菌质粒稳定底盘进行无抗生素生物合成
作者将BsΔ28、BsΔ44、BsΔyoyB和BsΔyueB应用于乙偶姻的无抗生素发酵。BsΔ28、BsΔyoyB、BsΔ44和BsΔyueB在48小时内的产量分别达到3.2 g/L、2.9 g/L、3.17 g/L和3.96 g/L。总体而言，BsΔyoyB和BsΔyueB菌株中乙偶姻生产的提高归因于质粒拷贝数的增加和合成途径基因的高表达水平。
为了验证底盘通用性，作者进一步应用于2,3-丁二醇（2,3-BDO）的无抗生素合成。作者优化了培养基，在48小时的无抗生素发酵后，使用BsΔ28和BsΔ44菌株的生产菌株分别达到了13.19 g/L和14.02 g/L的产量，因此，BsΔ28和BsΔ44的性能在多种化合物的无抗生素合成中得到验证。
图6 枯草芽孢杆菌在无抗生素化学发酵中的应用及平均PCN的测定
BsΔyueB底盘质粒稳定性提高的机制
作者对BsΔyueB和Bs168菌株进行了转录组分析。与Bs168菌株相比，BsΔyueB菌株中共有307个基因发生了差异性表达，其中32个基因上调，275个基因下调。经分析，作者认为BsΔyueB菌株中质粒稳定性提高的原因是由于孢子形成减少、细胞分裂改善和菌株适应性增强所带来的质粒分离稳定性增加。
图7 菌株BsΔyueB转录组分析
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.4c00241
免责声明：本文旨在分享生物合成与未来食品领域科研动态，不代表平台立场，不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准。本文也不是治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。
版权声明：标注‘原创’仅代表原创编译，本平台不主张对原文的版权。中文内容仅供参考，一切内容以期刊官网为准。
本平台转载仅仅是出于学术交流和传播信息的需要，并不意味着代表本平台观点或证实其内容的真实性；转载文章版权归原作者所有，作者如果不希望被转载或有侵权行为，请联系本平台删除。
摘译 | 王咏桐
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
审核 | 刘 娟
