ACS Synth Biol | 首尔大学：利用工程解脂耶氏酵母和大肠杆菌一锅法将烷烃转化为α,ω-二胺

方法1:作者首先通过在Y. lipolytica中引入转氨基途径生产α，ω-二胺。通过PCR扩增了Silicibactor pomeroyi、Chromobacterium violaceum、Agrobacterium tumefaciens和Vibrio fluvialis JS17中因对ω-脂肪醛27的活性而闻名的转氨酶的编码序列，并将其克隆到载体pBlank中以在解脂耶氏酵母中表达。在测试的候选物中，发现来自S. pomeroyi的转氨酶(SpTA)活性最高，活性为0.000115 U/mgDCW，因此被选中进行进一步优化。为了提高表达和细胞内活性，将SpTA克隆到具有各种复制起点、上游激活序列和启动子的载体中。载体系统pTA6使用强TEFintron启动子和位于启动子上游的具有酵母复制起点的UAS1B8，结果证明其活性最好，与使用较弱mLeu启动子的系统pTA2相比，活性提高了8.2倍（图1a）。活性的提高是由于酵母复制起点增加了细胞内拷贝数，上游激活序列充当了转录增强子。翻译延伸因子-1α(TEF)启动子（包括内含子序列）是Y. lipolytica中最强的启动子之一，它也有助于SpTA的细胞内表达在建立SpTA表达系统的基础上，进行了正构烷到α,ω-二胺的全细胞生物转化。在生物转化之前，作者构建了YALI2菌株，该菌株消除了游离脂肪酸降解途径，以确保整个二胺合成途径中的中间体得以保留。YALI2菌株是通过删除催化β-过氧化物酶体多功能酶1型，全细胞生物转化导致0.07 mMα,ω-二胺(6a)的形成和除醛以外的其他中间体的定量积累（图1b）。此外，α,ω-二酸(4a)的产生量为1.36 mM，是中间体中最主要的产物，从而表明Y. lipolytica中内源酶的过氧化活性远强于SpTA催化的胺化。此外，0.12 mM 5a仍未胺化。这进一步表明需要改进TA催化的胺化以高效生产α,ω-二胺(6a)。

图1 将转氨途径引入解脂耶氏酵母进行正构烷的胺化

接下来作者利用CRISPR-Cas9系统对解脂耶氏酵母进行工程改造，以阻止反应中间体的过度氧化。为了解决中间体过氧化的问题，作者列出了Y. lipolytica中参与正构烷氧化的26个基因。在这些基因中，发现四个（FALDH1-4）负责将脂肪醛转化为脂肪酸。作者使用CRISPR-Cas9系统删除了这四个基因，为了确定每个FALDH基因的过氧化活性，作者构建了四个菌株（YALI3-6），其中每个FALDH基因都被删除。在Y. lipolytica中，12-羟基十二烷酸(3a)通常被内源性氧化还原酶氧化为12-氧代十二烷酸。假设，如果FALDH参与脂肪醛向脂肪酸的转化，那么在FALDH缺失菌株中，由12-羟基十二烷酸(3a)生成1,12-十二烷二酸(4a)的产量将会降低。然后，作者使用这些菌株以12-羟基十二烷酸为底物进行全细胞反应（图2b）。正如预期的那样，与对照菌株(YALI2)相比，所有删除单个FALDH基因的菌株(YALI3-6)的4a产量均有所下降。在FALDH缺失菌株(YALI6)中，与YALI2相比，4a产量下降了46%，随后在FALDH1(YALI3)、FALDH3 (YALI5)和FALDH2 (YALI4)缺失菌株中分别下降了32%、13% 和13%。这些实验结果表明，Y. lipolytica中FALDH基因的多次删除累积有助于阻止醛的过度氧化。随后，作者利用CRISPR-Cas9系统依次从YALI6中删除FALDH1−3基因，构建了菌株YALI7、YALI8和YALI9。为评估基因缺失对游离脂肪酸降解途径和过氧化的影响，作者利用菌株YALI1、YALI2、YALI6、YALI7、YALI8和YALI9进行全细胞反应，以3a为底物（图2c）。结果显示，在含有内源性MFE1和FAA1基因的YALI1菌株中，4a仅残留0.1 mM，而删除这2个基因的其余菌株中4a均残留0.2mM以上。此外，随着依次删除FALDH4、FALDH1、FALDH3和FALDH2基因，12-氧代十二烷酸的过氧化程度降低。最初的YALI2菌株含有约0.4 mM的4a，而在YALI9中，由于所有FALDH1-4基因均被删除，浓度降至约0.25 mM。接下来作者评估了FALDH缺失对以3a为底物的二胺生成的影响，3a在TA的胺化活性下转化为12-氨基十二烷酸 (12-AmDDA)，或在FALDH的过氧化活性下转化为4a。YALI9菌株(YALI2FALDH1-4Δ)产生的2-AmDDA 量最高，为0.55 mM，与YALI2菌株产生的0.1 mM相比增加了5.5倍。对于YALI1，推测大多数中间体和产物将通过游离脂肪酸降解途径在细胞内消耗。正如预期的那样，在YALI6中，12-AmDDA的产量显著增强，该菌株是通过在YALI2中仅删除FALDH4基因构建的，增加了4.5倍(4.5 mM)。这表明，FALDH4（在脂肪醛过氧化中起主要作用）的缺失也显著促进了胺化途径的增强。随后，在YALI9中，FALDH1、2和3也被删除，合成0.55 mM 12-AmDDA时，产量略有增加。这进一步表明FALDH1-4基因之间存在过氧化活性差异。此外，为了增强胺化反应，作者尝试优化胺供体的供应。在之前的实验中，本研究使用了(S)-α-MBA，它通常用作TA催化的转氨反应中的胺供体。然而，由于其成本高，且苯乙酮（脱氨胺供体）对产物有很强的抑制作用，因此它带来了挑战。因此，在TA催化反应中，选择合适的胺供体并用熟练的回收系统去除抑制副产物变得非常重要。此前有报道称，TA的胺供体L-丙氨酸可以通过与丙氨酸转氨酶(ALT)的偶联反应再生。ALT催化丙氨酸和α-酮戊二酸之间氨基的可逆转移。因此，作者构建并检验了一种胺供体回收系统，使用丙氨酸转氨酶(ALT)作为辅助酶从丙酮酸中回收L-丙氨酸。作者选择了三种不同的ALT，分别来自解脂耶氏酵母(YlALT)、酿酒酵母(ScALT)和大肠杆菌K-12(K12ALT)，并评估了它们的L-丙氨酸回收情况。结果显示，使用L-丙氨酸作为转氨酶(TA)反应的胺供体导致12-AmDDA产量较低，从10 mM 3a中仅生成0.01 mM。然而，添加三种ALT中的一种后，12AmDDA产量明显增加。这种增强可能归因于 ALT 利用 L-谷氨酸作为共底物从丙酮酸中再生L-丙氨酸的能力。在测试的三种 ALT 中，采用 K12ALT 的反应表现出最高的 12AmDDA 产量，在10 mM L-谷氨酸存在下产生0.68 mM。随后，AHR和TA与ScALT和YlALT结合分别产生0.37和0.065 mM的12-AmDDA。根据这一结果，选择YlALT和K12ALT并将其克隆到pTA6中以与TA共表达。然而不幸的是，在Y. lipolytica中与TA共表达的选定K12ALT并没有显著改善Lalanine回收率。这可能是由于L-丙氨酸回收的热力学平衡不太有利，并且存在大量α-酮戊二酸和L-谷氨酸底物。该结果表明，胺供体再生系统具有挑战性，因为难以操纵细胞中的氨基酸池，并且L-丙氨酸作为TA的胺供体的活性较低。在对TAs有活性的胺供体中，苄胺价格相对便宜，并且在TA催化反应中表现出良好的反应性。当使用苄胺进行全细胞生物转化时，YALI9的产量比(S)-α-MBA氨基供体系统高出23%。为了进一步研究，使用苄胺作为胺供体。此外，以苄胺为胺供体，以1,12-十二烷二醇(2a)为底物，合成了1,12-二氨基十二烷 (6a)。正如预期的那样，YALI2菌株仅产生了0.015mM 6a，而YALI9 的产物形成量高出13倍 (0.19 mM)（图 S5）。然而，由于过度氧化反应，1,12-十二烷二酸(4a)仍然是主要产物。为了寻找一种能够有效阻止中间体过氧化反应的工程策略，作者发现Y. lipolytica中的脂肪醇氧化酶1(FAO1)基因参与催化过氧化反应。在基于大肠杆菌的生物转化反应中证实了FAO1的过氧化活性，并通过从YALI9菌株中删除FAO1基因构建了YALI10菌株。使用带有最佳pTA6载体系统的YALI10菌株进行反应，从10 mM的1a中产生了最高的0.2mM的12-二胺产物（6a）（图1b），这比之前报道的记录增加了5倍。

图2 利用 CRISPR-Cas9系统删除FALDH基因以阻止中间体的过度氧化

方法2：接下来作者利用Y. lipolytica和E. coli的微生物联合体一锅法生产二胺。在上述方法中，Y. lipolytica表现出氧化正构烷的巨大潜力。然而，中间体的过度氧化和Y. lipolytica中TA的低表达（为大肠杆菌的0.3%，）是普遍存在的问题。因此作者选择大肠杆菌BW25113(DE3)菌株作为T表达宿主，考虑到其高水平基因表达能力，并将其命名为胺化模块(AM)。AM是通过使用含有来自Synechocystis sp.PCC 6803的AHR的pET二重载体和含有来自S. pomeroyi的TA的pET24ma载体转化BW25113ΔfadD菌株构建的（图3）。在此，工程化的Y. lipolytica YALI2作为氧化模块(OM)催化正构烷烃的羟基化，大肠杆菌AM催化进一步氧化和胺化以产生相应的α,ω-二胺。使用正十二烷作为底物进行由OM和AM组成的双细胞联合体。这种细胞组合产生了0.37 mM6a，比上述方法中最优化的反应增加了1.85倍。然后作者对微生物菌群生产α,ω-二胺（OM/AM）碳源进行了优化，葡萄糖是广泛使用的底物之一，可为驱动OM提供恒定的辅因子，例如ATP和其他烟酰胺辅因子。然而，葡萄糖是TA催化反应中效率低下且有害的底物。虽然它提供了必要的辅因子，但它在糖酵解过程中产生了更多的丙酮酸。众所周知，丙酮酸是TA催化反应中良好的胺受体，从而阻碍了胺化反应产生α,ω-二胺的总通量。因此，选择合适的碳源和优化适当的量是这种方法的关键因素。考虑到这一点，作者使用葡萄糖作为碳源以不同的浓度进行反应。氧化中间体的浓度分布表明，初始葡萄糖浓度对各种反应中间体的积累有显著影响。在没有葡萄糖的情况下，50%的正十二烷被细胞吸收，而在存在10%葡萄糖的情况下，由于葡萄糖的消耗优势，只有约30%的正十二烷被吸收。另一方面，剩余的氧化化合物总量（包括2a、3a或4a）随着初始葡萄糖浓度的增加而增加。氧化化合物的浓度范围为0.5至近2 mM，这表明找到最佳葡萄糖浓度的重要性，为了更详细地阐明这种对α,ω-二胺(6)生成的影响，作者进行了使用OM和AM的双细胞联合体的反应。结果显示，该反应显示葡萄糖消耗与6a形成之间存在明显的正相关性。随着葡萄糖浓度从0增加到10%，6a的积累也相应地从0.03 mM增加到0.74 mM（比方法1高3.7倍）。然而，考虑到提供更多葡萄糖的成本和预期的二胺滴度，作者没有继续增加初始葡萄糖浓度。考虑到这些结果，10% 葡萄糖被用作有效供应辅因子和调节α,ω-二胺生成的最佳碳源。

图3 采用Y. lipolytica和E. coli的微生物联合体一锅法生产二胺代谢途径

由于AM具有出色的AHR和TA表达水平，OM和AM联合体表现出从1a生成6a的改进能力。然而，残留的过氧化仍产生了约1 mM的4a。然后作者考虑将α,ω-二酸还原回相应的α,ω-二醇。通常，羧酸的还原由CAR酶介导。因此，作者构建了一个基于大肠杆菌的还原模块(RM)，方法是将克隆在 pET24ma载体中的来自枯草芽孢杆菌的sfp磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和克隆在pET二重载体中的来自海洋分枝杆菌的羧酸还原酶(CAR)转化到BW25113ΔfadD 菌株。预计新建的RM将通过催化α,ω-二酸中间体(4)还原为α,ω-二醇来帮助缓解过度氧化问题。掌握了优化条件后，作者使用由工程化的OM、AM和RM组成的三细胞联合体进行了一锅反应。首先，作者制备了一组双细胞联合体联合体，1-4是通过将工程OM（YALI1、2、9和10）与AM结合而构建的。联合体1-4成功地从10 mM1a中产生了最高值1.95 mM6a（图 4）。与YALI1相比，工程OM YALI2、9和10倾向于消耗更多的1a，剩余约2 mM1a。尽管如此，联合体1-4都表现出残留的过氧化活性，积累了约1 mM 的4a。接下来，进行了由YALI10 OM、AM和RM组成的三细胞联合反应。正如预期的那样，获得了1a 到6a 的最高转化率（2.85 mM 6a；联合体5）。这一成果比YALI OM和AM的第一个联合体提高了3.9倍。此外，4a的产量大大降低至0.23 mM。这一结果表明，通过CAR还原4a可以有效解决过氧化效应。此外，OM 和AM协同催化1a羟基化、氧化和胺化生成6a。为了进一步提高OM对正构烷的羟基化，改变了联合体5中的细胞质量比。值得注意的是，当三个模块中的OM细胞数量增加2倍时，OM对正十二烷的羟基化作用增强，从而导致6a的产量随后增加。不过，作者注意到仍有超过1 mM的正十二烷未反应，这表明如果OM浓度更高，二胺产量可能会增加。为了促进正十二烷的羟基化，自拍这将 OM 浓度增加到OD₆₀₀为150。最终，6a产量比之前报道的最高值提高了91倍。

图4 不同微生物菌群从1a生成6a的反应产物概况

此外，作者还使用各种碳链长度的正构烷作为底物进行反应。使用1a−d作为底物的反应分别产生3.63、2.93、1.81和2.44 mM的相应α,ω-二胺(6a−d)（图5a）。这些发现表明，一锅式微生物联合体可用于生产各种碳链长度的α,ω-二胺。

图5 使用由YALI10 (OM)、AM（含有WTSpTA或R417F突变体）和RM组成的联合体，从1a−d生产各种链长的5a−d和6a−d