为什么帕金森病基因 PARK9 突变在小鼠与人类中的症状差异如此大？

文摘 2024-11-12 23:03 美国

在人类身上会导致严重帕金森病的基因突变，为什么在实验小鼠身上却毫无影响？

科学家们发现，在实验室培育的基因突变小鼠中存在一个有趣的现象：虽然这些小鼠从出生就携带着与人类帕金森病相关的ATP13A2基因突变，但即便年龄很大，它们也没有表现出类似帕金森病的症状。这与人类患者的情况形成鲜明对比，因为携带ATP13A2基因突变的人类患者往往在年轻时就会出现严重的帕金森病症状，如运动迟缓、肌肉僵硬和震颤等。

这种差异引发了科学家们的思考：为什么同样的基因突变在人和小鼠中会产生如此不同的结果？研究人员提出了一个巧妙的假设——也许是因为这些小鼠的大脑在发育过程中已经形成了某种"应对机制"，就像提前为即将到来的"风暴"做好了准备。基于这个想法，科学家们决定采用一种新的研究策略：等小鼠长大成年后，再突然删除它们大脑中的ATP13A2基因，看看在没有"准备时间"的情况下，小鼠会不会出现类似人类帕金森病的症状。

美国范安德尔研究所等研究团队在 npj Parkinson's Disease 期刊发表了一篇题为《在成年小鼠中删除ATP13A2基因诱导黑质纹状体通路多巴胺能神经元进行性退变和溶酶体异常》的研究论文。研究人员通过在成年小鼠大脑中选择性删除ATP13A2基因，成功构建了一个可以进行帕金森病研究的动物模型。

研究团队使用了基因工程技术，将携带Cre重组酶的腺相关病毒（AAV-Cre）注射到携带ATP13A2基因敲除位点的成年小鼠的黑质区域，从而在特定脑区选择性删除ATP13A2基因。通过免疫组织化学染色、Western blot分析、BaseScope原位杂交等多种方法，在注射后3个月和10个月的时间点观察和分析多个指标的变化。具体而言：

研究方法

1. 实验动物的选择与准备

研究团队使用了两种特殊的实验小鼠：一种是携带ATP13A2基因敲除位点的小鼠，另一种是对照实验用的ROSA26-LRRK2R1441C小鼠。这些小鼠都是2-6个月大的成年小鼠，在无特定病原体的环境中饲养，保证12小时昼夜交替，并自由进食和饮水。

2. 手术方法

研究人员使用2%异氟烷麻醉小鼠，将其固定在立体定位仪上。然后，通过精确的立体定位将病毒注射到小鼠大脑的特定区域（黑质）。注射的病毒有两种：一种是携带Cre重组酶的腺相关病毒（AAV-Cre），另一种是对照用的AAV-GFP。注射速度控制在每分钟0.2微升，总共注射2微升。

3. 基因表达的检测方法

研究人员使用了BaseScope原位杂交技术来检测ATP13A2基因的表达情况。这项技术可以直观地展示基因在组织中的表达位置和水平。此外，还用基因组PCR方法来确认基因是否被成功敲除。

4. 数据统计与分析

研究人员使用多种软件进行图像分析，如HALO分析软件测量纹状体中TH的光密度，StereoInvestigator软件计数黑质中的神经元数量。所有数据都用GraphPad Prism软件进行统计分析，结果以平均值±标准误差表示。

5. 观察时间点的设定

研究人员在注射病毒后的3个月、6个月和10个月分别收集样本进行分析，这样可以观察到神经退行性变化的动态过程。在每个时间点，都进行了全面的组织学和生化分析。

实验结果

1. ATP13A2基因敲除的验证

研究团队首先验证了基因敲除的效果。在注射AAV-Cre的小鼠黑质区域，基因组PCR显示ATP13A2基因的外显子2-3被成功删除。通过BaseScope原位杂交技术进一步证实，相比对照组，注射AAV-Cre的小鼠黑质区域ATP13A2 mRNA水平显著降低。免疫荧光分析显示，约65%的酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元和87%的parvalbumin阳性神经元表达Cre-GFP，而小胶质细胞和星形胶质细胞几乎不表达，说明基因敲除主要发生在神经元中。

2. 纹状体多巴胺能神经末梢的进行性丢失

在注射病毒3个月后，通过TH染色观察到注射AAV-Cre组纹状体中的多巴胺能神经末梢损失了29.05±6.19%，而对照组仅损失5.27±5.42%。到10个月时，AAV-Cre组的神经末梢损失进一步加重至47.67±5.16%，而对照组仍维持在较低水平（-20.10±15.93%）。这种进行性的神经末梢退变模式与帕金森病的病理进展特征相符。

3. 黑质多巴胺能神经元的选择性死亡

在注射3个月时，黑质区域的TH阳性神经元损失并不明显（12.67±7.81%）。然而到10个月时，AAV-Cre组的TH阳性神经元显著减少，损失达到34.68±4.99%，同时Nissl染色阳性神经元也减少了33.29±4.97%。值得注意的是，parvalbumin阳性神经元和GAD67阳性神经元数量没有明显变化，表明ATP13A2缺失特异性地影响多巴胺能神经元。

4. 神经炎症反应的时间特征

在注射3个月后，AAV-Cre组黑质区域的GFAP（星形胶质细胞标记物）信号显著增强，表明存在明显的星形胶质细胞活化。同时，Iba1阳性小胶质细胞的数量、密度和细胞体积都有所增加。然而到10个月时，这些炎症反应大多得到缓解，呈现出暂时性的特点。

5. 溶酶体功能障碍的表现

在注射10个月后，AAV-Cre组的多巴胺能神经元中LAMP2阳性溶酶体显著累积。定量分析显示，LAMP2阳性结构的数量、平均大小和总面积都明显增加。同时观察到p62阳性包涵体的形成，以及在部分细胞中TFE3转运至细胞核，这些都提示溶酶体功能受损。

6. 蛋白质聚集相关研究

研究人员还检测了α-突触核蛋白和tau蛋白的病理性聚集。在注射10个月后，并未观察到磷酸化α-突触核蛋白（pSer129）或磷酸化tau蛋白（AT8）的累积。同时，总α-突触核蛋白的水平也没有明显改变。这一结果与既往报道的ATP13A2相关神经退行性疾病患者的病理特征相符。

总结

这项研究成功构建了一个可靠的帕金森病动物模型，通过在成年小鼠中特异性删除ATP13A2基因，诱导了与人类帕金森病相似的进行性多巴胺能神经元退变。这一模型为研究帕金森病的发病机制和开发新的治疗方法提供了重要工具。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41531-024-00748-5

撰文｜Coral

责编｜Asher

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