哈兽研：非洲猪瘟病毒的 I7L 蛋白通过抑制 STAT1 的磷酸化，拮抗 IFN-γ 引发的 JAK-STAT 信号通路

非洲猪瘟（ASF）是一种对家猪、野猪和疣猪等具有高度传染性和致命性的出血性疾病，其致死率可达100%。自2018年非洲猪瘟病毒（ASFV）基因II型毒株传入中国以来，给中国的养猪产业带来了毁灭性的经济损失，并迅速蔓延至全国，严重影响了大规模生猪生产。尽管已有研究对ASFV的生物学特性和致病机制进行了广泛探讨，但目前对于ASFV的免疫逃逸机制仍不完全清楚。

图1.I7L蛋白（pI7L）的生物学特性

3.通过 RNA 测序 (RNA-seq) 分析发现 ASFV-ΔI7L 感染的 PAM 中的差异表达基因 (DEG)

通过RNA测序（RNA-seq）分析，研究人员比较了感染ASFV-ΔI7L（缺失I7L基因的ASFV突变株）和ASFV-WT（野生型ASFV）的原猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中的不同表达基因（DEGs）。研究发现，在感染ASFV-ΔI7L的PAMs中，与ASFV-WT感染的PAMs相比，DEGs主要涉及由干扰素-γ（IFN-γ）诱导的抗病毒免疫反应。特别是在4、12和20小时后，感染ASFV-ΔI7L的PAMs表现出与ASFV-WT感染的PAMs不同的基因表达模式。其中，12和20小时后，与IFN-γ和JAK-STAT信号通路相关的细胞反应的基因表达显著增加。此外，感染ASFV-ΔI7L的PAMs在12和20小时后诱导产生更高水平的IFN-γ刺激基因（ISGs），如IRF1、GBP1、SOCS1和CXCL10。

图2.通过 RNA 测序分析 ASFV-ΔI7L 感染的原代猪肺泡巨噬细胞 (PAM) 中的差异表达分析

4.I7L 基因缺失的 ASFV 突变体激活 IFN-γ 触发的 JAK-STAT 信号通路

研究发现，I7L基因缺失的ASFV突变体（ASFV-ΔI7L）能够显著提高IFN-γ的产生，并激活IFN-γ触发的JAK-STAT信号通路。与ASFV-WT相比，ASFV-ΔI7L感染的原猪肺泡巨噬细胞（PAMs）表现出更高水平的IFN-γ蛋白和IFNG基因转录。此外，经IFN-γ预处理的PAMs感染ASFV-ΔI7L后，其病毒滴度和基因组拷贝数显著低于ASFV-WT，说明I7L蛋白能够拮抗IFN-γ的抗病毒活性。进一步分析显示，与ASFV-WT感染的PAMs相比，ASFV-ΔI7L感染的PAMs在20小时后，IRF1、CXCL10、SOCS1、GBP1和CXCL9等IFN-γ刺激基因（ISGs）的转录水平更高。

5.pI7L 抑制 IFN-γ 引发的 JAK-STAT 信号通路

pI7L被证实能够抑制IFN-γ触发的JAK-STAT信号通路。通过一系列实验，研究人员发现pI7L蛋白能够与STAT1直接相互作用，并抑制其磷酸化和二聚体形成，这一过程依赖于pI7L蛋白第98位的酪氨酸(Y98)残基。这种抑制作用减少了STAT1的核内转移，从而降低了IFN-γ刺激基因的产生。此外，研究人员还发现pI7L能够以剂量依赖性方式抑制IRF1启动子的激活，并减少由IFN-γ诱导的ISGs的转录水平。

图3.pI7L 抑制 IFN-γ 引发的 JAK-STAT 信号通路

6.pI7L 通过靶向 STAT1 抑制 JAK-STAT 信号通路

通过谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉实验，确认了pI7L与STAT1之间的特异性相互作用，而与其他JAK-STAT通路的关键分子如IFNGR1、JAK1、JAK2没有相互作用。进一步的免疫共沉淀（co-IP）实验和激光共聚焦显微镜观察，都证实了pI7L与STAT1在细胞内的相互作用和共定位。

此外，研究人员还发现pI7L能够抑制STAT1在Y701位点的磷酸化，并且阻断了磷酸化STAT1（p-STAT1）的核内转移。这些结果表明，pI7L通过与STAT1相互作用，抑制了其在IFN-γ刺激下的活化过程。

通过构建含有不同突变的pI7L蛋白的实验，研究人员发现Y98位点的突变（Y98A）显著减弱了pI7L与STAT1的相互作用以及对STAT1磷酸化的抑制作用。

图4.pI7L 通过靶向 STAT1 来抑制 IFN-γ 触发的 JAK-STAT 信号通路

7.pI7L 抑制磷酸化并阻断 STAT1 的核转位

在这项研究中，pI7L被证明能够抑制STAT1的磷酸化并阻断其核内转移。研究人员通过转染实验，观察到过表达pI7L的细胞在经IFN-γ处理后，STAT1的Y701位点磷酸化水平显著降低。此外，通过细胞分馏实验进一步证实了pI7L能够减少磷酸化STAT1（p-STAT1）从细胞质转移到细胞核的数量，从而抑制了其核内转移。

通过共免疫沉淀实验，研究人员还发现pI7L能够与STAT1相互作用，并且这种相互作用依赖于pI7L蛋白第98位的酪氨酸残基（Y98）。此外，通过构建pI7L(Y98A)突变体并进行实验，研究人员发现Y98A突变显著减弱了pI7L对STAT1磷酸化的抑制作用以及对STAT1核内转移的阻断作用。

这些结果表明，pI7L通过直接与STAT1相互作用，特别是依赖于其Y98残基，抑制了STAT1在IFN-γ刺激下的磷酸化和核内转移，进而抑制了JAK-STAT信号通路的激活。

图5.pI7L 抑制 STAT1 磷酸化并阻止其核转位

8.STAT1 的 SH2 结构域特异性识别 pI7L 的 pTyr

STAT1 的 SH2 结构域特异性识别含有 pTyr 的配体蛋白 ，我们的研究结果揭示了 pI7L 与 STAT1 之间的相互作用。随后，我们研究了 pI7L 是否发生酪氨酸磷酸化以及 pI7L-STAT1 相互作用是否依赖于 STAT1 的 SH2 结构域。co-IP 结果表明，pI7L 发生了酪氨酸磷酸化修饰，如兔抗磷酸酪氨酸单克隆抗体 (MAb) 所检测到的 ，并且 STAT1 依赖于其 SH2 结构域与 pI7L 相互作用 。

9.pI7L 抑制 STAT1 的磷酸化和同型二聚化，具体取决于 Y98 残基

这项研究中，pI7L通过其Y98残基抑制了STAT1的磷酸化和同源二聚体形成。研究人员发现，pI7L蛋白能够与STAT1特异性相互作用，并且这种相互作用对于pI7L抑制STAT1的激活至关重要。具体来说，pI7L蛋白的Y98残基对于其与STAT1的结合以及抑制STAT1在Y701位点的磷酸化至关重要。通过构建pI7L蛋白的Y98A突变体，研究人员证实了这一点，即Y98A突变显著减弱了pI7L对STAT1磷酸化和二聚体形成的抑制作用。

此外，研究人员还发现pI7L蛋白能够干扰STAT1与JAK1的结合，这是STAT1磷酸化的关键步骤。pI7L通过竞争性地与STAT1结合，从而阻止了JAK1对STAT1的磷酸化，进而抑制了STAT1的活化和二聚体形成。这种抑制作用最终导致了IFN-γ诱导的JAK-STAT信号通路的抑制，减少了抗病毒基因的表达。

图6.pI7L 根据 98 位酪氨酸抑制 STAT1 的磷酸化

10.I7L 基因与 ASFV 体内致病性相关

在这项研究中，研究人员探讨了I7L基因与非洲猪瘟病毒（ASFV）体内致病性的相关性。通过构建I7L基因缺失的ASFV突变株（ASFV-ΔI7L），并在猪体内进行感染实验，研究人员发现与感染野生型ASFV（ASFV-WT）的猪相比，感染ASFV-ΔI7L的猪表现出较低的死亡率、延迟的死亡时间和减轻的病毒血症。

具体来说，感染ASFV-ΔI7L的猪在感染后3、5和7天产生的IFN-γ水平显著高于感染ASFV-WT的猪，表明I7L基因的缺失促进了宿主体内的IFN-γ产生。此外，感染ASFV-ΔI7L的猪肺组织中抗病毒基因（如GBP1、STAT1、SOCS1和CXCL9）的表达水平也显著高于感染ASFV-WT的猪。这些结果表明，I7L基因的缺失增强了宿主对ASFV感染的免疫反应。

进一步的血清学分析显示，感染ASFV-ΔI7L的猪能够诱导产生针对ASFV的抗体，而感染ASFV-WT的猪则没有检测到这些抗体。这些发现进一步证实了I7L基因在ASFV致病性中的作用，并暗示了I7L基因可能作为未来疫苗开发和病毒致病机制研究的潜在靶点。

图7.I7L 基因与 ASFV 对猪的致病性有关

11.ASFV-ΔI7L 在猪体内诱导的免疫反应比 ASFV-WT 更高

在这项研究中，研究人员发现与野生型ASFV（ASFV-WT）相比，缺失I7L基因的ASFV突变株（ASFV-ΔI7L）在猪体内能诱导出更强的免疫反应。具体表现在以下几个方面：

1. IFN-γ产生增加：感染ASFV-ΔI7L的猪在感染后的3、5和7天，血清中IFN-γ的水平显著高于感染ASFV-WT的猪，说明ASFV-ΔI7L能更有效地刺激猪产生IFN-γ，这是一种关键的抗病毒细胞因子。

2. 抗病毒基因表达上调：在ASFV-ΔI7L感染的猪肺组织中，诸如GBP1、STAT1、SOCS1和CXCL9等抗病毒基因的表达水平显著上调，表明ASFV-ΔI7L感染增强了宿主的抗病毒基因反应。

3. 抗体应答增强：感染ASFV-ΔI7L的猪在感染后的第10天和第7天，分别产生了针对ASFV的p30和p72抗体，而感染ASFV-WT的猪则未检测到这些抗体。这表明ASFV-ΔI7L能诱导出更好的体液免疫反应。

这些结果表明，I7L基因的缺失降低了ASFV的致病性，并且可能有助于提高宿主的免疫保护。因此，ASFV-ΔI7L可能是研究ASFV免疫机制和开发疫苗策略的有价值工具。

图8.ASFV-ΔI7L 在猪体内诱导的免疫反应比 ASFV-WT 更高

本研究深入探讨了非洲猪瘟病毒（ASFV）中I7L基因的功能及其编码蛋白pI7L在病毒致病性中的角色。研究发现，pI7L能够通过抑制STAT1的磷酸化和同源二聚体形成来阻断IFN-γ触发的JAK-STAT信号通路，从而帮助病毒逃避宿主的免疫反应。这一发现为理解ASFV如何调控宿主免疫应答提供了新的见解。

通过构建I7L基因缺失的ASFV突变株（ASFV-ΔI7L），研究人员进一步证实了I7L基因在病毒致病性中的作用。在猪体内实验中，与野生型ASFV相比，ASFV-ΔI7L感染的猪表现出较低的死亡率和延迟的死亡时间，血清中IFN-γ水平和抗病毒基因表达显著上调，抗体应答也更为显著。这些结果表明，I7L基因的缺失不仅降低了ASFV的致病性，还增强了宿主的免疫反应。

总的来说，这项研究不仅揭示了ASFV pI7L蛋白的免疫逃逸机制，还为未来ASFV疫苗的设计和开发提供了潜在的靶点。通过删除或突变关键的病毒免疫调节基因，可以开发出减毒活疫苗，从而在不引起疾病的情况下激发宿主的免疫保护。这些发现对于控制ASFV的传播和减少其对养猪产业的破坏性影响具有重要意义。

 ASFV pI7L 在 ASFV 感染后负向调控针对 STAT1 的 JAK-STAT 信号通路的示意图

https://oi.org/10.1371/journal.ppat.1012576.g009

校对：Collin

投稿合作：shouyiyanquan@163.com