西北大学曹利平团队Aggregate：超分子AIE型光敏剂用于光动力治疗的共价和非共价结合的受限分子内旋转策略

光动力疗法（PDT）是有前景的无创靶向癌细胞破坏方法，其中光敏剂（PSs）因其能触发包括超氧阴离子在内的活性氧物种（ROS）的生成而至关重要。而聚集诱导发光（AIE）材料可以通过分子间聚集抑制分子内旋转（RIR）以限制能量耗散，从而增强了ROS的生成。

曹利平和党东锋团队研发了一种新型AIE型超分子聚合物PS。其通过基于TPE的分子笼与CB[8]整合而成。该整合过程通过共价和非共价RIR策略相结合，采用了分子工程合成与主客体组装。首先，采用两个四（吡啶-4-乙烯基）TPE衍生物作为笼的表面，利用间二取代苄基作为连接臂共价连接，生成双层TPE基八阳离子笼（1-2）以缩小两个TPE表面间的空间距离，从而增强其RIR（方案1）。与单层TPE衍生物（3）相比，化合物1由于笼内TPE旋转受限，表现出增强的系间穿越（ISC），使单重态（S）和三重态（T）间的能量差（ΔE）大幅减小，从而高效生成ROS。其次，得益于CB[8]中的羰基入口和大疏水空腔，化合物1和四条带正电的吡啶鎓乙烯臂可以通过疏水作用和离子偶极相互作用被封装在CB[8]空腔内，形成1：4的主客体络合物（1@CB[8]₄）（方案1B）。CB[8]空腔进一步限制了TPE单元的旋转，从而提高了其产O₂^−•能力。

方案1：（A）通过分子工程合成共价RIR，（B）通过主客体组装得到的非共价RIR以及（C）涉及ROS的生成和NADH的氧化的协同光动力疗法示意图。

首先，作者通过四（吡啶基-4-乙烯基）TPE（4）与1，3-双（溴甲基）苯（5）两步反应同步合成TPE笼型化合物1和2（图1A）。并通过直接甲基化4，获得了单层TPE模拟物（3•4Cl^-）。此外，在该研究中，3被作为参考物质来评估笼状化合物及其基于CB[8]的主客体组件产生ROS的能力。随后，作者获得了1和2的单晶结构，结果显示两者均具有笼状结构，尺寸为22.6-23.7 Å（长）×15.8-18.5 Å（宽）×5.3 Å（高）。在化合物1中，上下平面的TPE表面呈镜像对称排列，其中央双键相互平行（图1B）。相比之下，化合物2中的两个TPE表面呈现错位排列，其中央双键彼此垂直（图1C）。值得注意的是，间二取代苄基的连接单元使上下TPE表面之间的距离压缩至5.3 Å，形成拥挤的结构。

图1：（A）1-3的合成路线：（i）MeCN, 90℃, 3 days, then NH₄PF₆;（ii）4, TBAI, MeCN, 110℃, 3 days；（iii）excess TBACl；（iv）MeI, MeCN, 90℃, 3 days, then NH₄PF₆。（B）1•8PF₆^-和（C）2•8PF₆^-的X射线单晶结构。

接着，作者通过NMR实现确定1或2与CB[8]的主客体组装。¹H NMR滴定实验结果表明CB[8]的腔体可能位于笼臂的双键位置周围（图2A），并且主客体复合物的化学计量比为1：4。此外，所有质子信号在扩散排序光谱中具有相同的分子扩散系数（D=1.6×10^-10 m²S^-1），这表明溶液中1和CB[8]仅形成了一种类型的主客体复合物。2和CB[8]的¹H NMR滴定实验也显示了同样的1：4的主客体组装。随后的等温滴定量热实验显示，1和2与CB[8]的各自的结合位点的表观结合常数（K_a）分别为（1.03±0.46）×10⁷ M^-1和（1.76±0.16）×10⁷ M^-1（图2B）。随后，作者通过UV-vis和荧光滴定实验进一步研究了1或2与CB[8]络合后的光物理性质。在将1至4.0 eq的CB[8]逐渐加入1的水溶液中，导致吸收峰显著红移（Δλ=40 nm）(图2C)。这一变化是因为1与CB[8]的结合限制了吡啶鎓乙烯臂的自由转动，增强了吡啶鎓乙烯臂与中心TPE集团之间的π-电子共轭。在荧光滴定实验中，水溶液中1表现出微弱的橙色发射，绝对量子产率低，荧光寿命短。而当加入4.0 eq的CB[8]形成1@CB[8]₄络合物后，1@CB[8]₄的荧光强度和寿命显著增加，这是由于有效的共振能量转移所致（图2D）。同样，2与CB[8]的主客体复合物也得到类似的结果。这些结果表明，超分子复合体相较于单独的笼状分子，展现出更强的可见光吸收能力，这使得其能够有效地吸收可见光以生成ROS。而1和2在结合到CB[8]的腔内会导致TPE单元在上下表面的分子内旋转进一步受限。

图2：（A）1（0.40 nM）与CB[8]（4.0 eq）的部分¹H NMR谱图。（B）CB[8]（50 μM）在298 K水中滴定1的等温量热曲线。1•8Cl^-（10 μM）和CB[8]（0-10.0 eq）在水中的（C）UV-vis滴定曲线和（D）荧光滴定曲线。（E）1@CB[8]₄的质谱图。

作者随后探究了通过共价和非共价限制分子内旋转策略促进的ROS的生成能力。DCFH作指示剂的结果显示，相比于3，1和1@CB[8]₄表现出更强的ROS生成能力（图3A）。而DHR123作指示剂的结果也显示相较于3，1和1@CB[8]₄生成O₂^−•的能力更强（图3B）。此外，作为¹O₂指示剂的ABDA吸光度在分别存在3、1和1@CB[8]₄时显著下降，证实了其相似的产¹O₂能力（图3C）。因此，共价及非共价RIR均能增强PS的¹O₂生成能力。同时，作者也电子顺磁共振（EPR）光谱法研究3、1和1@CB[8]₄在白光照射下通过5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）捕获O₂^−•产生信号。所有的PSs在白光照射后均产生DMPO-OOH信号，表明O₂^−•的生成（图3D）。实验结果表明，与1和3相比，1@CB[8]₄诱导的DMPO-OOH信号显著增强，与荧光结果一致。同时，2，2，6，6-四甲基吡啶（TEMP）作为一种¹O₂传感器，在白光照射下，PSs捕获3、1和1@CB[8]₄产生的¹O₂后，表现出四甲基哌啶氧化自由基的三重态信号，表明其三重态与氧气分子自建同样发生了能量转移过程（图3E）。作者通过激光闪光光解法测量了PSs（3、1和1@CB[8]₄）三重态的寿命，计算结果分别为4.0、6.2和13.8 µs（图3F），1@CB[8]₄的荧光寿命更长。三重态延长寿命有助于PSs向其他物质的能量或电子的转移，从而提升ROS的生成效率。

理论计算结构表明这些AIE化合物的最高占据轨道（HOMO）主要集中在吡啶乙烯基部分，而最低未占分子轨道（LUMO）则主要分布于TPE骨架上。化合物1的HOMO和LUMO间距优于化合物3，更利于ΔE的降低。作者还分别计算了化合物1的S态和T态的能量。值得注意的是，化合物1的S态和T态间的ΔE仅为0.26 eV，远低于化合物3的0.60 eV（图3H）.这证实了1相较于3具有更小的ΔE值，这有望促进ROS生成效率的提升。而相较于单一分子笼，超分子复合物1@CB[8]₄在产生 I 型ROS方面展现出更高效率。因此，笼结构与主客体络合所带来的RIR效应共同作用，有助于缩小ΔE值，进而提升整体性能。

图3：（A）ROS，（B）O₂^−•和（C）3，1，和1@CB[8]₄在白色LED灯（20 mWcm^-2）照射下产生¹O₂，分别以DCFH，DHR123，ABDA作为指示剂。检测在不同照射时间和以DMPO和TEMP作为自旋捕获器的由1@CB[8]₄产生（D）¹O₂和（E）O₂^−•的ESR谱图。（F）激光闪光光解法测量在水中，550 nm下3，1，1@CB[8]₄的三重态的寿命。（G）1和3的HOMO-LUMO分布图和（H）能级图。

接着作者研究了NADH的光催化氧化过程，揭示了3、1和1@CB[8]₄在生物化学反应中作为光催化的可行性。NMR实验结果表明，在298 K下，经白光照射30分钟后，1@CB[8]₄的存在使NADH大部分转化为氧化态NAD（图4A）。而在没有光催化剂的条件下，NADH的变化并不显著。UV-vis也被用于监测NADH的氧化过程。在白光照射下，1@CB[8]₄体系中NADH在339 nm处的特征吸收峰的降低证明了NADH转化为NAD（图4B）。使用O₂^−•清除剂叠氮化钠（NaN₃）和苯醌（BQ）控制实验，结果显示NADH的氧化在加入NaN₃后继续发生，而在加入BQ后不发生，表明1@CB[8]₄的光催化氧化使通过白光照射下产生的O₂^−•的氧化活性实现的，此外，O₂^−•被还原成具有细胞毒性的H₂O₂，这有可能对于消除癌细胞做出贡献。

图4：光催化氧化NADH的示意图。（A）在水中，1@CB[8]₄（5 mol%）存在下，NADH在白色LED灯（20 mWcm^-2）照射下光催化氧化过程的部分NMR谱图。（B）NADH分散在含有1@CB[8]₄（10 μM）的水中，在白色LED灯（20 mWcm^-2）照射不同时间时的吸收光谱。（C）不同催化剂（10 mol%）作用下，NADH（100 μM）在339 nm处的吸收比A/A₀随时间变化图。

最后，基于1和1@CB[8]₄的高ROS活性和高效氧化NADH的能力，研究了其在体外的抗肿瘤效应。结果表明，在0-10 μM浓度范围内，1和1@CB[8]₄在无光条件下表现出极低的细胞毒性和良好的生物相容性。而在常氧（21% O₂）或低氧（1% O₂）条件下，1@CB[8]₄的细胞毒性显示出与浓度的强烈相关性，而1在测试浓度范围内几乎无细胞杀伤性（图5A）。随后，作者研究了HeLa细中的NADH水平。在0-5 μM浓度下，经白光照射，与1相比，存在1@CB[8]₄时，NADH的浓度显著下降（图5B）。而无论是常氧还是低氧条件下，光照后的2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯发出明亮的绿色荧光，证明1@CB[8]₄的产生ROS的能力。此外，利用二氢乙锭研究了两种光敏剂的产O₂^−•效果，结果表明1@CB[8]₄具有更高的产O₂^−•能力。为了评估其光动力治疗（PDT）效果，作者在常氧和低氧条件下采用倒置荧光显微镜研究了钙黄素素乙酰氧基甲酯（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI），结果显示，在常氧和低氧条件下，1和1@CB[8]₄均能杀死HeLa细胞，而在相同浓度下，1@CB[8]₄显示出更佳的PDT效果。

基于1@CB[8]₄良好的体外效果，作者研究了其活体PDT性能。结果显示，治疗组的肿瘤体积和重量显著小于对照组，并且在评估期间，小鼠均无死亡，且并未观察到体重的显著差异（图5H），这些结果表明1@CB[8]₄在PDT过程中表现出低毒性。此外，治疗组的肿瘤体积和重量显著小于对照组（图5E-G），这表明1@CB[8]₄处理的能有效抑制机体内肿瘤的生长。并且组织学分析表明1@CB[8]₄处理的肿瘤切片表现出明显的凋亡和坏死（图5I）。

图5：（A）在白光照射（400 - 800 nm，50 mWcm^-2，1 min）和常氧（21% O₂）或低氧（1% O₂）条件下，由1@CB[8]₄处理的HeLa细胞的细胞活力。(B)在白光照射下（400-800 nm，100 mWcm^-2，1 min），对1和1@CB[8]₄浓度范围内的HeLa细胞内的NADH水平进行定量分析。(C)在白光照射（400-800 nm，20 mWcm^-2，1 min）和低氧（1% O₂）条件下，用DCFH和二氢乙锭检测HeLa细胞中的ROS和O₂^−•。(D)在缺氧（1% O₂）条件下，Calcein-AM/PI染色的HeLa细胞在有无白光照射（400-800 nm，100 mWcm^-2，1 min）情况下的CLSM图像。不同处理条件下的（E）相对应的肿瘤图像，（F）肿瘤体积生长曲线，和（G）肿瘤重量。（I：PBS；II：PBS+光照；III：1@CB[8]₄；IV：1@CB[8]₄+光照。）(H)荷瘤小鼠的体重。(I)治疗后来自荷瘤小鼠的肿瘤组织和主要器官的染色切片。

综上所述，作者通过分子工程合成与主客体组装相结合的共价和非共价限制性内旋策略，开发了一种新型超分子PS（1@CB[8]₄），由笼型TPE化合物（1）与CB[8]大环通过主客体相互作用形成。笼型结构与主客体复合物的形成共同减少了该超分子体系中单线态与三线态之间的能隙，促进了超分子PS生成ROS尤其是O₂^−•的能力。鉴于其高效的O₂^−•生成能力，1@CB[8]₄络合物能够迅速氧化NADH，破坏其细胞内平衡，阻碍相关生理过程，从而促进癌细胞死亡。因此，在这种缺氧环境中，该超分子光敏剂通过ROS毒性和NADH氧化的协同效应下，在光动力疗法中展现出高效的治疗效果。

Title: A combination of covalent and noncovalent restricted-intramolecular-rotation strategy for supramolecular AIE-type photosensitizer toward photodynamic therapy

Authors: Qingfang Li, Peijuan Zhang, Pingxia Wang, Chaochao Yan, Kaige Wang, Wanni Yang, Dongfeng* and Dang Liping Cao*

To be cited as: Aggregate, 2024, e676.

DOI: 10.1002/agt2.676