首先为了建立从(S)-网状番荔枝碱合成白屈菜红碱的生物合成途径,作者将来自罂粟科植物的参与白屈菜红碱及其前体合成的异源基因(包括McoBBE、AmSMT、AmTDC、PsTNMT、PsMSH、PsP6H、McoDBOX和PsCPR)引入菌株Z0(图1a)。靶基因与绿色荧光蛋白的融合验证了Z0中每个基因的表达。在10 mL试管中以28°C培养10天后,由于代谢途径中的酶失衡,LC-MS无法检测到白屈菜红碱的积累,这表明参与催化该途径的酶活性可能不足。BBE催化(S)-网状番荔枝碱到(S)-scoulerine的初始立体特异性氧化和加成反应步骤,是血根碱生物合成途径中的限速酶。为了在Z0中筛选出(S)-scoulerine合成的高效酶,对来自罂粟科植物的四种BBE进行了比较,在细胞外提供 100 µM (S)-网状番荔枝碱后,对(S)-scoulerine产量进行LC-MS分析,结果表明菌株Z0(McoBBE)产生的(S)-scoulerine浓度更高,从(S)-网状番荔枝碱到(S)-网状番荔枝碱的转化效率为21.92%(图1b)。考虑到BBE位于液泡中,作者设计了一个截短突变体tMcoBBE,根据SignalP-5.0的转运肽预测,删除了24 个残基。该突变体在细胞溶胶中表达,与McoBBE相比,其白屈菜红碱产量增加了31.42%。同样的作者将不用来源的SMT分别在菌株Z0中进行异源表达。在这些候选菌株中,TfSMT 突变体表现出色,当使用100 µM(S)-scoulerine作为底物时,可产生18.61 mg/L的(S)-四氢鸽胺(图1c)。为了优化该过程的关键酶,基于底物相似性从不同植物来源中筛选了TNMT和P6H。结果表明,来自E.californica的EcTNMT和EcP6H有效提高了白屈菜红碱的产量。(图1d和e)
图1 白屈菜红碱的生物合成途径及候选酶的筛选
三个功能模块(模块A、B和C)分别对应碳碳形成、初步甲基化/氧化和多重甲基化/氧化反应,用于设计由(S)-网状番荔枝碱合成白屈菜红碱的合成途径(图2a)。对于碳碳键形成模块,将tMcoBBE插入菌株Z0的染色体中,生成工程酵母Z1,用于由(S)-网状番荔枝碱生物合成(S)-scoulerine,转化率为28.62%(图2b)。模块B包括SMT和TDC,这两种酶对于将(S)-scoulerine转化为(S)-canadine必不可少。由于其高催化和特异性,A.mexicana AmTDC被直接用于构建白屈菜红碱途径。考虑到细胞色素P450单加氧酶需要细胞色素P450还原酶(CPR)的氧化还原伴侣,TfSMT突变体、AmTDC和P.somniferum PsCPR基因表达盒被整合到Z0中,产生了菌株Z2。当将100 µM(S)-scoulerine添加到SC培养基中时,菌株Z2合成(S)-canadine,滴度为9.91 mg/L(图2b)。从(S)-canadine合成白屈菜红碱的模块C涉及四种酶:TNMT、MSH、P6H 和DBOX。因此,将编码EcTNMT、PsMSH、EcP6H、McoDBOX和PsCPR的密码子优化的表达盒整合到菌株Z0中,产生菌株Z3。使用100 µM(S)-卡那定作为底物,该菌株能够生产3.76 mg/L的白屈菜红碱。即使没有将McoDBOX整合到菌株Z0中,工程酵母Z3’中也观察到了白屈菜红碱的合成(图2c),这表明存在一种或多种内源酶,可以催化白屈菜红碱合成的最后一步。鉴于其最大比生长速率较高(菌株Z3’为0.35 h−1,菌株Z3为0.30 h−1),且白屈菜红碱合成水平与菌株Z3相当(,菌株Z3’被选为构建白屈菜红碱合成途径的平台菌株。为了构建能够从(S)-网状番荔枝碱生产白屈菜红碱的菌株,通过整合编码 McoBBE、TfSMT和AmTDC的基因表达盒对菌株Z3’的基因组进行了修改,从而产生了菌株Z4。LC-MS和LC-MS/MS分析证实,Z4可以成功生产滴度为0.34 µg/L的白屈菜红碱。
图2 重建白屈菜红碱的生物合成途径
接下来作者为了提高代谢通量,通过检查每种酶(尤其是P450)的多个拷贝对Z4中白屈菜红碱合成的影响,选择和整合多拷贝限速基因,系统地优化了白屈菜红碱生物合成途径。首先,利用质粒pRS416在菌株Z4中过表达单个基因tMcoBBE、TfSMT、AmTDC、EcTNMT、PsMSH和EcP6H(图 3a),分别产生菌株Z401–Z406。结果发现,所有代谢基因的过表达均不同程度地提高了白屈菜红碱的产量(图3c),表明该途径中基因拷贝数的扩增增强了白屈菜红碱的合成。多种P450的表达可能具有挑战性,并且经常导致异源生物合成途径中的代谢瓶颈,菌株Z403、Z405和Z406对P450基因(分别为TDC、MSH和P6H)过度表达具有高敏感性,导致白屈菜红碱产量增加5至10倍(图3c),这表明 P450 活性有限。为了解决这个问题,对P450的位置大小、表达水平和催化效率进行了系统优化。考虑到异源表达的植物来源的P450和CPR位于内质网(ER),ER的大小与其蛋白质合成和折叠能力密切相关。为了增加P450过表达和活性增强的附着位点,作者扩增了参与萜烯合成的关键转录因子INO2,以扩大ER的大小(图3a)。所得菌株Z407的白屈菜红碱产量显著提高,为2.54 µg/L,比亲本菌株Z4提高了7.47倍(图 3c)。此外,表达替代植物CPR,如PsCPR、拟南芥AtATR1和AtATR2,可增强白屈菜红碱合成中的P450活性(图3a)。作者的研究结果表明,除AtATR2外,这些特定基因的过度表达显著增强了Z408和Z409中的白屈菜红碱产量,菌株Z4中表达PsCPR和AtATR1,滴度分别为0.93和0.95 µg/L,与菌株Z4相比分别增加了173.53%和179.41%(图3c)。这表明CPR的过度表达可以显著增加白屈菜红碱生物合成途径中的P450活性。为了进一步促进白屈菜红碱的合成,将多基因盒A(包括限速基因TfSMT、AmTDC、EcTNMT、PsMSH、EcP6H、PsCPR和INO2)整合到菌株Z4的基因组中。添加这些基因的多个副本以生成菌株Z5-Z9(图3b)。这些菌株的白屈菜红碱滴度显著提高,菌株Z9的产量为29.15 µg/L,比菌株Z4高出约83倍(图3d)。在菌株Z9中进行了第二次限速基因筛选,以进一步优化代谢图2重建的白屈菜红碱生物合成途径。a 酿酒酵母中从(S)-网状番荔枝碱到白屈菜红碱的生物合成途径。b 白屈菜红碱生物合成的模块化组装。c 菌株Z0、Z3、Z3′和其标准的白屈菜红碱的提取离子色谱图。重组菌株在含有100 µM 底物的SC培养基中培养10天,并通过LC-MS途径分析所得代谢物(图3a)。在菌株Z9中过表达单个基因tMcoBBE、TfSMT、AmTDC、EcTNMT、PsMSH、EcP6H、INO2、PsCPR 和AtATR1分别产生菌株 Z901至Z909。但仅在过表达MSH、ATR1和INO2的菌株中白屈菜红碱产量增加明显(图3e)。因此,将包含限速基因MSH、ATR1和INO2的多基因盒B整合到菌株Z9中,产生不同拷贝的工程菌株Z10–Z13(图3b)。通过两轮多拷贝限速基因的迭代整合,获得了菌株Z13,其白屈菜红碱产量最高,为74.74 µg/L(图3f)。
图3 调控限速步骤P450以实现高效生产白屈菜红碱
接下来作者采用了三种策略来设计血红素生物合成:强化限速酶、消除反馈抑制和减少血红素降解(图4a)。限速酶HEM2和HEM3的共同过表达使菌株Z14中的白屈菜红碱产量(92.54 µg/L)与亲本菌株Z13相比提高了24.90%(图4b)。Z15通过联合过表达血红素生物合成的关键酶HEM12实现了进一步的改进。ROX1的缺失抑制了HEM13活性和线粒体呼吸作用,导致白屈菜红碱产量增加,菌株Z16的产量为106.36 µg/L(图4b)。与菌株Z16相比,编码负责血红素降解的血红素加氧酶的HMX1基因的缺失使Z17菌株的白屈菜红碱产量进一步提高了18.52%(126.06 µg/L)(图4b)。先前的研究表明,以血红素生物合成的直接前体5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)作为底物可显著提高酵母细胞内的血红素水平。还研究了外部补充5-ALA对白屈菜红碱生成的影响,但未观察到显著增加(未显示数据),表明在这种情况下5-ALA不是限制性前体。
图4 通过调节血红素供应提高P450效率
鉴于NADPH是白屈菜红碱生物合成途径中几个催化步骤中的关键电子转移辅因子(图5a),NADPH缺乏可能会因电子转移效率低下而降低P450活性。为了增加白屈菜红碱的产量,将编码胞浆NADP+依赖性乙醛脱氢酶的ALD6基因引入菌株Z17以增强NADPH的产量。然而,该菌株中的白屈菜红碱滴度并未显著增加,NADPH/NADP+比率仍然很低,表明细胞内NADPH仍然不足,需要增强再生。戊糖磷酸途径(PPP)已被确定为NADPH的主要来源(图5a)。将PPP中的关键基因ZWF1(编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)整合到菌株Z17中,得到菌株Z18,其白屈菜红碱产量为144.22 µg/L,提高了14.39%(图5b)。然而,尽管白屈菜红碱滴度有所提高,但Z18中的NADPH/NADP+比例仍然不足。为了进一步增加NADPH的供应,将GND1(编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶,可催化PPP中NADP+二次氧化还原为NADPH)引入菌株Z18,得到菌株Z19。与菌株Z18相比,白屈菜红碱滴度提高了9.83%,达到158.40 µg/L(图5b)。为了提高PPP通量,过表达编码2个转酮醇酶和1个转醛醇酶的基因TKL1、TKL2和TAL1,得到菌株Z20,其白屈菜红碱产量为172.51µg/L,比菌株Z19提高了8.91%(图5b)。此外,通过组合表达编码磷酸酮醇酶的Leuconostoc mesenteroides LmXFPK和编码磷酸转乙酰酶的Clostridium kluyveri CkPTA,并删除编码GAP磷酸酶的GPP1,得到的菌株Z21产量为195.03µg/L(图5b),比菌株Z17提高了54.69%。这些研究结果表明,参与PPP通路的ZWF1、GND1、TAL1、TKL1、TKL2、XFPK和PTA可以增加NADPH/NADP+比例,从而增加白屈菜红碱的产量。合成途径的调节大大提高了工程酵母中白屈菜红碱的产量。然而,白屈菜红碱在菌株Z21中主要在细胞内积累,需要细胞外运输才能促进进一步的合成。为了解决某些生物碱在植物中的积累问题,人们已经鉴定出几种植物来源的转运蛋白,用于生物碱的运输。四种转运蛋白,包括M.cordata McoABC 、Medicago truncatula MtABCG10、Catharanthus roseus CrTPT2和Coptis japonica CjABCB2,分别被整合到菌株Z21中,以实现白屈菜红碱的细胞外运输。幸运的是,整合了MtABCG10基因的改造菌株Z22能有效降低胞内积累,从而提高胞外白屈菜红碱的积累,总滴度提高了54.06%,达到303.74 µg/L(图5c)。白屈菜红碱的胞内与胞外比例从6:1(169.00至28.16 µg/L,菌株Z21)变为0.74:1(129.43至174.31 µg/L,菌株Z22),而其他重组菌株中白屈菜红碱的积累保持不变(图5c)。与菌株Z21相比,菌株Z22中胞外与胞内前体(即别隐品碱和二氢白屈菜红碱)的比例显著增加。
图5 NADPH再生和产物胞外运输调节以实现最佳的白屈菜红碱生物合成
为提高白屈菜红碱的产量,优化了实验发酵条件,包括改变初始接种浓度和培养基对目标化合物积累的影响。随着接种量的增加,单位体积白屈菜红碱的积累量也相应增加。当初始接种浓度的OD600为 40 时,菌株 Z22 中的白屈菜红碱产量达到 1214.47 µg/L,此后一直保持这一水平。在YPD培养基中使用菌株Z22进行的补料实验表明,与SC培养基相比,10天内白屈菜红碱产量增加了78.01%,达到2161.82 µg/L。采用优化的培养基和接种浓度,在0.5L生物反应器中通过基于pH的补料分批发酵,在表现最佳的菌株Z22中,白屈菜红碱滴度提高到12.61 mg/L(图6)。
图6 用于生产白屈菜红碱的补料分批发酵
原文链接:
https://doi.org/10.1186/s12934-024-02513-y
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摘译 | 胡方林
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
审核 | 刘 娟