【文献解读】四川大学程冲最新AM：富电子钌团簇治疗炎症性脊髓损伤

第一作者：Jinglun Liu

通讯作者：廖立、程冲

通讯单位：四川大学

研究背景

    创伤性脊髓损伤（SCI）是一个严重的神经病理挑战，通常由外伤引起，导致持续的感觉和运动功能缺失，严重影响患者的身心健康。当前针对SCI的治疗大多效果不佳，尽管甲基泼尼松龙已被临床使用，但其疗效有限且副作用明显。创伤后，炎症反应导致活性氧物质（ROS）的大量释放，造成氧化应激，损害细胞稳态，阻碍受损神经元再生。有效清除受伤部位的ROS已被证实能够保护脊髓结构完整性并抑制巨噬细胞的激活，从而对SCI恢复至关重要。尽管内源性抗氧化酶在维持细胞氧化还原平衡中起着重要作用，但其应用受到一些限制。因此，材料科学家致力于模仿天然抗氧化酶的机制，开发创新的生物催化ROS清除材料。近年来，金属氢氧化物如氢氧化铜（Cu(OH)₂）因其良好的生物相容性和生物降解性而受到广泛关注，然而其原始材料对多样化ROS物种的清除能力有限，因此亟需设计有效且广谱的Cu(OH)₂基础的ROS清除材料，以应对SCI相关的氧化应激问题。

    最近的研究揭示，设计高效生物催化ROS清除剂的瓶颈在于处理涉及H₂O₂分子和氧自由基的复杂多电子反应，然而在这方面的成功进展有限。因此，迫切需要创新的结构设计策略，以促进富电子催化中心的构建，从而增强电子转移的可及性并促进含氧中间体的多电子反应。通过非化学计量工程或缺陷工程引入富电子催化位点，可以显著增强电子在缺陷位点的重分布和累积，这一概念在生物催化和组织再生领域尚未得到充分探索。因此，期待通过在Cu(OH)₂基底上构建氧空位缺陷的富电子催化位点，能够创造出具有卓越效率、最低毒性和广泛抗氧化特性的生物催化ROS清除剂。

研究内容

    本文提出了一种创新的合成方法，利用含有氧空位缺陷的非化学计量氢氧化铜（Ru/def- Cu(OH)₂）构建富电子的钌簇，作为生物催化ROS清除剂，以有效抑制炎症级联反应并调节脊髓损伤（SCI）后的内源性微环境（图1）。研究的主要动机有两个方面：一是Cu(OH)₂基底中的氧空位促进电子重分布，增强钌簇与含氧物种的结合，从而提高生物催化ROS清除能力；二是Ru/def- Cu(OH)₂展现出优越的广谱抗氧化能力，能够有效对抗氧化应激并恢复SCI后炎症微环境中的生理功能。实验和理论分析表明，氧空位的形成暴露了更多的非化学计量Cu原子，增强了钌簇的电子密度，有助于克服涉及含氧物种的多电子反应挑战。以H₂O₂的CAT样催化清除为例，Ru/def-_Cu(OH)2的Vmax达到68.26 µM s⁻¹，周转数（TON）为5.60 s⁻¹，显著超越现有文献中的生物催化材料。Ru/def- Cu(OH)₂的抗氧化能力能够减少死神经元数量，减轻ROS引起的细胞损伤，并通过抑制巨噬细胞激活和激励神经干细胞、抗炎巨噬细胞（M2）及少突胶质细胞，创造强大的修复微环境，从而有效修复创伤性SCI。总之，合成的Ru/def- Cu(OH)₂展现出前所未有的生物催化抗氧化能力，为开发ROS清除和抗炎材料提供了有前景的策略，以应对创伤性SCI及其他与氧化应激相关的疾病。

Figure 1 Schematic process of utilizing Ru/def- Cu(OH)₂ to suppress the inflammatory cascades and modulate endogenous microenvironments for repairing SCI.

图文解析

    为了解决创伤性脊髓损伤（SCI）部位炎症损伤的挑战，研究团队开发了一种高效且广谱的生物催化ROS清除剂——Ru/def- Cu(OH)₂。该材料的合成从富含氧空位缺陷的纳米棒状Cu(OH)₂（称为def- Cu(OH)₂）开始，结合水热合成和碱处理，随后在常温下通过搅拌24小时引入钌金属离子。X射线衍射、电子自旋共振、扫描电子显微镜和高角环形暗场扫描透射电子显微镜等分析确认了其晶体结构和缺陷形态。结果显示，Ru簇围绕缺陷存在，促进了电子的暴露和重分布。进一步的X射线光电子能谱和X射线吸收光谱分析表明，Ru/def- Cu(OH)₂中Ru与Cu之间存在电子转移和金属-O键的形成，增强了其对多电子反应的抗氧化能力。整体研究表明，氧空位的存在增加了Ru簇周围非化学计量Cu原子的暴露，进而提升了其抗氧化能力，显示出Ru/def- Cu(OH)₂在治疗SCI及其他氧化应激相关疾病中的应用潜力。

Figure 2 Design and synthesis of biocatalytic Ru/def- Cu(OH)2.

    在对合成的Ru/def- Cu(OH)₂进行详细表征后，作者系统评估了其生物催化ROS清除特性。首先，通过DPPH自由基实验评估了其抗氧化活性，结果表明Ru/def- Cu(OH)₂在清除自由基方面明显优于未经修饰的def- Cu(OH)₂。其次，Ru/def- Cu(OH)₂展现出优异的GPx样和SOD样活性，H₂O₂消除效率及超氧阴离子消除比率均显著高于def- Cu(OH)₂。此外，在时间依赖性CAT样活性测试中，Ru/def- Cu(OH)₂能够在16分钟内将H₂O₂浓度降低约85.66%。长期稳定性测试显示，其催化活性在六个循环中保持高效，且O₂生成量显著优于def-Cu(OH)₂。通过动力学分析，Ru/def-Cu(OH)₂的最大反应速率（Vmax）和周转数（TON）分别为68.26 µM s⁻¹和5.60 s⁻¹，显示出其卓越的催化动力学性能。结构研究表明，Ru/def-Cu(OH)₂中的氧空位促进了Ru簇的电子积累，提升了其对多电子反应的抗氧化能力。此外，使用红外光谱和密度泛函理论计算进一步探讨了Ru原子与H₂O₂的相互作用，表明Ru在H₂O₂分解中的关键作用。这些发现强调了Ru/def-Cu(OH)₂作为高效抗氧化剂的潜力，主要归功于其独特的氧空位促进的电子积累机制。

Figure 3 Biocatalytic ROS-elimination activities of Ru/def-Cu(OH)2.

    经过确认Ru/def-Cu(OH)₂作为一种有效的类抗氧化酶材料，具有广泛而强大的ROS清除能力后，作者全面评估了其缓解氧化应激和恢复炎症微环境中生理功能的能力。最初，作者评估了Ru/def-Cu(OH)₂在间充质干细胞、鼠神经施旺细胞和小鼠单核巨噬细胞中的细胞生物相容性，结果显示其在1和5 µg mL⁻¹浓度下对细胞活力和增殖没有显著的细胞毒性，而def-Cu(OH)₂在5 µg mL⁻¹浓度下则表现出显著毒性。因此，选择1 µg mL⁻¹浓度用于后续的体外实验。通过DCFH-DA染色评估细胞内ROS水平，结果表明Ru/def-Cu(OH)₂能有效中和H₂O₂诱导的细胞内ROS，而H₂O₂和def-Cu(OH)₂处理组则显示明显的高ROS水平。进一步的活死细胞双重染色和细胞计数试剂盒分析表明，Ru/def-Cu(OH)₂显著降低了H₂O₂存在下各细胞类型的死亡细胞发生率，强调其在中和细胞内ROS和对抗氧化应激方面的优越保护效能。

Figure 4 In vitro ROS clearance and cell protection by Ru-def/Cu(OH)2.

    随后，作者评估了Ru/def-Cu(OH)₂对间充质干细胞（MSCs）和鼠神经施旺细胞（RSC96）形态特征及细胞骨架排列的影响。结果显示，在H₂O₂暴露条件下，Ru/def-Cu(OH)₂处理的细胞展现出明显扩展的细胞扩展面积，接近非应激健康细胞的表型。克隆形成实验强调了Ru/def-Cu(OH)₂在增强MSCs存活率和恢复其增殖活力方面的作用，即使在持续的氧化应激下。此外，伤口愈合实验表明，Ru/def-Cu(OH)₂促进了MSCs和RSC96细胞的迁移功能，支持了炎症环境中的细胞迁移和修复过程。为了深入探讨不同处理对MSCs神经分化倾向和多能状态保持的影响，作者进行了神经诱导实验，发现与H₂O₂和def-Cu(OH)₂处理组相比，Ru/def-Cu(OH)₂处理组的Nanog和Nestin表达水平显著提高。对于神经修复至关重要的施旺细胞在H₂O₂处理组中MBP表达下降，但Ru/def-Cu(OH)₂的应用促使MBP水平恢复。总体而言，Ru/def-Cu(OH)₂在应对氧化应激时有效保护了细胞形态并恢复了MSCs和RSC96细胞的功能。

Figure 5 Cell function protection by Ru-def/Cu(OH)2 under oxidative stress.

    作者评估了Ru/def-Cu(OH)₂对LPS诱导的Raw264.7巨噬细胞极化的影响，采用实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析。结果显示，与def-Cu(OH)₂相比，Ru/def-Cu(OH)₂在抑制诱导性一氧化氮合酶（iNOS）、白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎细胞因子的mRNA水平上具有显著效果，同时增强与抗炎活性相关的基因表达，如精氨酸酶-1（Arg-1）、白介素-10（IL-10）和转化生长因子β（TGF-β）。在LPS刺激下，Ru/def-Cu(OH)2有效减少了CD68荧光，表明其抑制了促炎巨噬细胞（M1）表型的转化，而def-Cu(OH)₂没有明显效果。同时，Ru/def-Cu(OH)₂处理促进了CD163表达的增加，表明巨噬细胞向抗炎表型（M2）极化。这些结果证实，Ru/def-Cu(OH)₂不仅减轻了促炎反应，还促进了巨噬细胞向M2表型的极化，从而为组织修复创造了更有利的环境。

Figure 6 Macrophages polarization regulation effects by Ru/def-Cu(OH)2.

    鉴于Ru/def-Cu(OH)₂在保护细胞抵御氧化应激、促进细胞功能恢复和调节巨噬细胞极化方面的显著效果，作者评估了其在动物模型中的治疗效果。实验设计将大鼠分为四组：未干预的对照组、接受胶原治疗的胶原组、接受胶原包封的Ru/def-Cu(OH)₂治疗的Ru/def-Cu(OH)₂组，以及接受胶原包封的def-Cu(OH)₂治疗的def-Cu(OH)₂组。术后立即给予Ru/def-Cu(OH)₂以清除ROS，结果表明Ru/def-Cu(OH)₂组在脊髓结构保持、内源性再生活性和运动功能恢复方面优于对照组，且未观察到主要器官的长期结构损伤。组织学分析显示，Ru/def-Cu(OH)₂组在脊髓损伤后的组织保存更加完整，组织损失减少，并且神经细胞保留显著高于其他组。此外，Ru/def-Cu(OH)₂组的髓鞘残留明显增加，MBP的增产也表明其增强了髓鞘形成过程。运动功能恢复方面，Ru/def-Cu(OH)₂组的BBB评分持续高于其他组，显示了其在维持受损区域结构完整性和促进功能恢复方面的潜力。研究还旨在描述脊髓损伤后Ru/def-Cu(OH)₂处理对局部免疫细胞反应的影响，通过免疫染色分析小胶质细胞和巨噬细胞的促炎和抗炎表型。

Figure 7 In vivo SCI recovery promoted by Ru/def-Cu(OH)2.

    研究发现，Ru/def-Cu(OH)₂显著减少了CD68阳性细胞群体，同时增加了CD206的表达，这一调节免疫微环境的效果表明了向更具修复性表型的转变，有利于组织修复。此外，对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的免疫荧光染色显示，Ru/def-Cu(OH)₂处理组的胶质瘢痕形成程度降低，从而可能促进脊髓再生过程中的内源性修复机制。此外，生长相关蛋白-43（GAP-43）的免疫荧光染色信号在Ru/def-Cu(OH)₂处理组中增强，表明该处理促进了神经再生反应及损伤脊髓区域神经干细胞的激活。

Figure 8 Impaired microenvironments regulated by Ru/def-Cu(OH)2.

文章结论

    本研究设计了一种高效、广谱且精确的Ru/def-Cu(OH)₂生物催化剂，具有丰富的氧空位缺陷，作为生物催化ROS清除剂用于创伤性脊髓损伤（SCI）的治疗。实验和理论分析表明，独特的氧空位使得Cu(OH)₂基体中更多的非化学计量Cu原子暴露，促进电子重分布并增强Ru簇的电子积累，从而提高了多电子反应的效率，增强了生物催化ROS清除活性。Ru/def-Cu(OH)₂展现出多种抗氧化特性，包括SOD、CAT和GPx样的ROS消除能力。在H₂O₂的CAT样催化清除中，Ru/def-Cu(OH)2的最大反应速率（Vmax）达到68.26 µM s⁻¹，周转数（TON）为5.60 s⁻¹，显著优于文献中报道的最先进生物催化剂。该催化剂显著降低了细胞内ROS浓度，减少了氧化应激下的细胞死亡，逆转了损伤区域神经元和胶质细胞的命运，并恢复了神经功能。此外，Ru/def-Cu(OH)₂通过抑制巨噬细胞激活和保护神经干细胞、M2巨噬细胞及少突胶质细胞，创造了有利于修复的微环境。在有效浓度下，Ru/def-Cu(OH)₂表现出良好的短期生物相容性，长期未观察到主要器官的显著结构损伤。

因此，这种具有氧空位缺陷的高效人工Ru/def-Cu(OH)₂生物催化剂在开发高效ROS清除材料用于创伤性SCI治疗方面具有重要进展。

文献链接：https://doi.org/10.1002/adma.202411618