原核表达的四个关键节点，助力蛋白表达纯化
之前讲了很多基础实验，因为基础实验其实是科研的重中之重，所谓的复杂实验也不过是基础实验的有机融合，如果可以将基础实验做的非常透彻，那复杂实验大概也不会难住你，唯手熟尔 。
今后我们多讲一些进阶的复合实验帮助大家更好的深入的解决科学问题。
现在简单介绍一下原核表达，原核表达是在大肠杆菌内表达我们所研究的目的基因，通过蛋白表达、蛋白纯化，制备高纯度的目的蛋白，从而在体外研究目标蛋白的生化功能。后依据目标蛋白的生化功能进一步帮助我们判断和分析目的基因在生物体内的生化功能和生物学功能，帮助我们解释目的基因和生物学表型之间的关联。
原核表达主要考虑以下四个方面：（以下按对目的蛋白表达影响的重要性排序）
一，首先是载体选择的选择对蛋白表达情况至关重要。
主要看表达载体的载体骨架和所使用的助溶标签，两者对蛋白表达量及可溶性均有显著影响。常用的推荐表达载体如PET28系列载体，PET-sumo载体、pGEX-4T的GST标签载体、pMal C2x的MBP标签载体、pCold-TF的冷激活表达载体、以及针对互作蛋白研究的PETDUET的共表达载体。表达蛋白时建议按照上述顺序进行载体骨架尝试。
如果你常作原核表达可能会发现我是从小标签助溶蛋白到大标签助溶蛋白排序的，助溶标签的确可以帮助目的蛋白表达在上清当中，但是大分子量的助溶标签也有可能会影响最终融合蛋白的性质和生化功能，拿不到最真实可靠的结果。所以在尝试表达载体时，一般都推荐从小助溶标签开始尝试，最直接的就是PET28a，PTE28a并无助溶蛋白，如果能在PTE28a中可溶的表达出来，自然是极好的，当以包涵体的形式表达出来时，就只能再尝试GST/SUMO的助溶标签，以及进一步的MBP/TF助溶标签等。
二，其次看表达目标蛋白本身的DNA序列和蛋白质的高级结构，蛋白质本身的DNA序列是否符合表达宿主的密码子偏好性，是否存在大量稀有密码子影响密码子阅读，从而进一步影响蛋白翻译速率导致蛋白不表达，或者表达量极低，此时可以进行密码子优化提高蛋白质的表达翻译效率；另外高级结构会影响蛋白质稳定性，可以考虑对目的蛋白全长序列进行截短，对无序区域进行优化，只表达包含重要结构域区域，从而提高蛋白表达纯化的可行性。
三，看原核表达的宿主菌即BL21或者Rosetta等大肠杆菌，或者其他菌种，宿主菌本身对目的蛋白的表达情况也有着显著影响。一般默认Rosetta菌株表达效果优于BL21菌株，主要因为Rosetta菌株中补充了更多的稀有密码子，提高翻译效率等，做了更多的菌种上的优化。大肠以外的常用菌种主要有枯草杆菌表达系统以及链霉菌表达系统，这里仅列举原核表达系统，真核表达以后有机会再讲，因为蛋白的表达纯化真的是一个非常复杂的实验
四，看蛋白纯化过程本身，蛋白质是生命活动的执行者，因此蛋白实验有一个非常关键的问题就是活性问题。因为蛋白质常对温度敏感，对缓冲液环境敏感，如果你纯化出来的蛋白是失活的自然是不能做体外实验的，因此在蛋白纯化过程中保证蛋白质的活性是非常重要的。一般是通过全程低温加蛋白酶抑制剂防止防止蛋白质的变性和降解
单纯从做实验的角度讲，我认为个人的实验水平分为道、法、术三种层次。
刚入门的初学者，一般处于“术”的层次，这时你只能按着说明书一步步的做，原理可能略知一点，但难以前后贯通，离开说明书或者标准方法，实验就难以进行。
经过一段时间锻炼的后，成为实验老手会进入“法”的层次，在这种水平你基本可以前后连贯的阐述所有实验原理，你大概已经背的滚瓜烂熟了，每一步是怎么做，为什么这么做，这一步做错了会导致什么实验结果，这种东西其实在做实验中就应该感受到了。
最后一种层次，也是最高的水平是“道”，道是很难形容的一种水平，在法的层次精通无数实验之后，你可能会进入这种境界，一切从原理出发，一切反应从脑海中模拟每一步的发生和结果。因为你积累了足够多的经验，你对蛋白质、RNA、DNA等生物样品的特性了如指掌，对他们的化学性质了如指掌，你将过去所有实验中最本质的原理和逻辑抽象出来总结为自己的思考逻辑，这样在面对一个全新的实验时，它也难不住你，因为你对所有操作对象的特性了如指掌，虽然没有一个标准流程给你，但你知道应该如何兼顾实验中不同物质的特点，如何去操作它。这是一种“道”的境界，你可以极快的上手绝大部分没做过的实验，因为不同的实验其背后的底层原理是相同的。在这种水平，你也可以快速拿到想要的实验结果，因为你在做之前就已经知道这个实验的难点在哪里，要怎么处理才能解决这个难点。
最后祝大家早日步入“道”的层次！关注我，我们一起领略科研背后的底层逻辑
