近日，华中科技大学甘璐/杨祥良教授联合东南大学中大医院滕皋军院士，在nature nanotechnology上发表了研究论文 Targeted intervention in nerve–cancer crosstalk enhances pancreatic cancer chemotherapy。神经与癌症的相互作用因其对肿瘤生长、转移和治疗抵抗的影响而受到广泛关注。在复杂的肿瘤微环境中，有效针对肿瘤相关神经的治疗策略仍然是胰腺癌的一大挑战。本研究开发了一种以大肠杆菌Nissle 1917为基础的外膜囊泡，结合了神经结合肽NP41，并加载了肿瘤生长因子受体（Trk）抑制剂larotrectinib（Lar@NP-OMVs），以实现对肿瘤相关神经的靶向干预。Lar@NP-OMVs有效干预神经，通过干扰神经营养因子/Trk信号通路抑制神经突起的生长。此外，OMV介导的M2型肿瘤相关巨噬细胞向M1型表型的极化导致神经损伤，进一步增强了Lar@NP-OMV诱导的神经干预，抑制了神经刺激的胰腺癌细胞增殖和迁移以及血管生成。利用这一策略，Lar@NP-OMVs显著减少了gemcitabine促进的肿瘤微环境中神经浸润和神经突起生长，从而提高了胰腺癌化疗的疗效。本研究为神经靶向治疗干预以增强胰腺癌治疗提供了一种潜在的途径。

图 1 | 胰腺肿瘤中的肿瘤神经支配

a. Lar@NP-OMVs的制备示意图。通过将Lar负载至源自EcN的NP41结合外膜囊泡（OMVs）中获得Lar@NP-OMVs。

b. Lar@NP-OMVs作为一种有效药物调节肿瘤组织中的神经以增强胰腺癌化疗的示意图。Lar@NP-OMVs不仅靶向并抑制神经营养因子/Trk信号通路以抑制神经功能，还将M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）极化为M1型表型以造成神经损伤。因此，Lar@NP-OMVs有效消除了GEM诱导的神经生成，抑制了神经触发的癌细胞增殖和迁移以及血管生成，从而增强了胰腺癌的化疗效果。

c–e,i TUBB3（c）、NEFH（d）、TH（e）和NTRK1（i）的表达与胰腺癌患者的总生存率之间的相关性，通过Kaplan–Meier绘图法进行分析（http://kmplot.com）。列出了P值（log-rank, Mantel-Cox检验）、风险比（HR）和患者数量。

f. 人胰腺肿瘤组织及相邻肿瘤旁组织中GAP43和β3-微管蛋白的代表性免疫荧光染色。细胞核用4′,6-二氨基-2-苯基吡啶（DAPI）染色。比例尺，50 µm。图像代表三份独立样本。

g,h. 如f所示的GAP43+（g）和β3-微管蛋白+（h）区域的定量分析。数据以平均值±标准差（n=12个场来自3个生物独立样本）表示。

j. 显示来自东南大学中大医院胰腺导管腺癌（PDAC）患者的高Trk表达和低Trk表达患者的总生存率的Kaplan–Meier曲线。列出了P值（log-rank, Mantel-Cox检验）和患者数量。g和h中的P值使用无配对双尾Student’s t检验确定。

图 2 | Lar@NP-OMVs在体外有效抑制神经功能

a. 通过冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）确定的OMVs、NP-OMVs、Lar@OMVs和Lar@NP-OMVs的形态。比例尺，50 nm。图像代表三份独立样本。

b. PC12细胞在存在神经营养因子（NGF）的情况下，经过PBS、OMVs、NP-OMVs、Lar、Lar@OMVs或Lar@NP-OMVs处理72小时后的神经突起生长代表性图像。图像代表三次独立实验。比例尺，25 µm。

c,d. 经过b中所示处理后，PC12细胞的平均神经突起长度（c）和具有神经突起细胞的比例（d）。数据以平均值±标准差（n=3个生物独立样本）表示。

e. PC12细胞在存在NGF的情况下，经过PBS、OMVs、NP-OMVs、Lar、Lar@OMVs或Lar@NP-OMVs处理48小时后的细胞活力。数据以平均值±标准差（n=4个生物独立样本）表示。

f–h. 经过b中所示处理后，PC12细胞中Tubb3（f）、Gap43（g）和Nefl（h）的mRNA表达水平，通过实时逆转录聚合酶链反应（RT–PCR）测定。数据以平均值±标准差（n=3个生物独立样本）表示。

i–k. 经过a中所示处理后，PC12细胞上清液中NE（i）、5-HT（j）和DA（k）的含量，通过酶联免疫吸附实验（ELISA）测定。数据以平均值±标准差（n=4个生物独立样本）表示。

c–k中的P值通过单因素方差分析（ANOVA）及随后进行的Tukey多重比较检验确定。

图 3 | Lar@NP-OMV处理的神经有效抑制癌细胞生长、迁移及血管生成

a. 在与经过PBS、OMVs、NP-OMVs、Lar、Lar@OMVs或Lar@NP-OMVs处理的PC12细胞上清液共培养48小时后，Panc02细胞的细胞活力，通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测。数据以平均值±标准差（n=3个生物独立样本）表示。

b,c. 经过处理的PC12细胞上清液共培养7天后，Panc02细胞的代表性克隆图像（b）及克隆数量定量（c），用结晶紫染色。数据以平均值±标准差表示（n=3个生物独立样本）。

d,e. 在与经过处理的PC12细胞上清液共培养12小时后，Panc02细胞的迁移代表性图像（d）及定量分析（e），通过迁移小室实验（transwell assay）进行评估。比例尺，50 µm（d）。数据以平均值±标准差表示（n=3个生物独立样本）。

f,g. 在与经过处理的PC12细胞上清液共培养12小时后，HUVECs的迁移代表性图像（f）及定量分析（g），通过伤口愈合实验（wound healing assay）进行评估。比例尺，200 µm（f）。数据以平均值±标准差表示（n=5个生物独立样本）。

h,i. 在与经过处理的PC12细胞上清液共培养9小时后，血管数量的代表性图像（h）及定量分析（i），通过管腔形成实验（tube-formation assay）进行评估。比例尺，200 µm（h）。数据以平均值±标准差表示（n=9个场来自3个生物独立样本）。

b、d、f和h中的图像代表三次独立实验。a、c、e、g和i中的P值通过单因素方差分析（ANOVA）及随后进行的Tukey多重比较检验确定。

图 4 | Lar@NP-OMV处理的M2型巨噬细胞有效抑制神经功能。

a–f. 胰腺癌患者肿瘤组织中神经标志物（包括GAP43（a）、NEFH（b）、NEFL（c）、UCHL1（d）、THY1（e）和TRPV2（f））的表达与M2型巨噬细胞浸润水平之间的相关性，通过TIMER2.0进行分析（n=179）。TPM表示每百万转录本。显示了最佳拟合线及其95%置信区间（以灰色高亮显示）。每个图的Spearman秩相关系数和P值（双尾）均已列出。

g–j. IL-4刺激的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）在经过PBS、OMVs、NP-OMVs、Lar、Lar@OMVs或Lar@NP-OMVs处理24小时后，CD80+（g）、CD86+（h）、TNF+（i）和CD206+（j）细胞的比例，通过流式细胞术测定。数据以平均值±标准差表示（n=3个生物独立样本）。

k,l. 在经过PBS、OMVs、NP-OMVs、Lar、Lar@OMVs或Lar@NP-OMVs处理的IL-4刺激的BMDMs上清液共培养24小时后，PC12细胞的细胞活力（k）和凋亡（l）。数据以平均值±标准差表示（n=4个生物独立样本）。

m. 在经过k中所示处理的IL-4刺激的BMDMs上清液共培养72小时后，PC12细胞的神经突起生长代表性图像。图像代表三次独立实验。比例尺，50 µm。

n,o. 经过m中所示处理后，PC12细胞的平均神经突起长度（n）和具有神经突起细胞的比例（o）。数据以平均值±标准差表示（n=3个生物独立样本）。

g–l、n和o中的P值通过单因素方差分析（ANOVA）及随后进行的Tukey多重比较检验确定。

图 5 | Lar@NP-OMVs在胰腺癌Panc02原位肿瘤小鼠中有效的抗癌活性和改善肿瘤微环境

a. 胰腺癌Panc02原位肿瘤小鼠抗癌实验的示意图，经过静脉注射（i.v.）PBS、OMVs、NP-OMVs、Lar、Lar@OMVs或Lar@NP-OMVs后进行处理。

b,c. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠的肿瘤图像（b）和肿瘤重量（c）。比例尺，1 cm（b）。数据以平均值±标准差表示（n=8只小鼠每组）。

d,e. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠的肠道（d）和肠道内转移性肿瘤结节的代表性图像（e）。黑箭头指示转移性肿瘤结节。比例尺，1 cm（d）。数据以平均值±标准差表示（n=8只小鼠每组）。

f. 经过处理后的原位Panc02肿瘤小鼠的生存曲线，通过Kaplan–Meier生存分析绘制（n=8只小鼠每组）。

g–i. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠肿瘤组织中CD80+（g）、CD86+（h）和CD206+（i）巨噬细胞的百分比，通过流式细胞术测定。数据以平均值±标准差表示（n=6只小鼠每组）。

j,m. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠肿瘤组织中GAP43（j）和CD31（m）的免疫荧光染色代表性图像。细胞核用DAPI（蓝色）染色。图像代表三次独立实验。比例尺，50 µm。

k,n. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠肿瘤组织中GAP43+（k）和CD31+（n）区域的定量。数据以平均值±标准差表示（n=3只小鼠中的10个场）。

l. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠肿瘤组织中的NE含量（n=5只小鼠每组）。c、e、g–i、k、l和n中的P值通过单因素方差分析（ANOVA）及随后进行的Tukey多重比较检验确定。

图 6 | GEM与Lar@NP-OMVs组合治疗在胰腺癌Panc02原位肿瘤小鼠中显示出强效的抗癌活性和改善的肿瘤微环境

a. 胰腺癌Panc02原位肿瘤小鼠抗癌实验的示意图，经过静脉注射（i.v.）PBS、GEM、Lar@NP-OMVs或GEM与Lar@NP-OMVs的组合后进行处理。

b,c. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠的肿瘤图像（b）和肿瘤重量（c）。比例尺，1 cm（b）。数据以平均值±标准差表示（n=6个生物独立样本）。

d,e. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠的肠道（d）和肠道内转移性肿瘤结节的代表性图像（e）。黑箭头指示转移性肿瘤结节。比例尺，1 cm（d）。数据以平均值±标准差表示（n=6只小鼠每组）。

f. 经过处理后的原位Panc02肿瘤小鼠的生存曲线，通过Kaplan–Meier生存分析绘制（n=8只小鼠每组）。

g,i,o. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠肿瘤组织中GAP43（g）、β3-微管蛋白（i）和CD31（o）的免疫荧光染色代表性图像。细胞核用DAPI（蓝色）染色。图像代表三次独立实验。比例尺，50 µm。

h,j,p. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠肿瘤组织中GAP43+（h）、β3-微管蛋白+（j）和CD31+（p）区域的定量。数据以平均值±标准差表示（n=3只小鼠中的10个场）。

k. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠肿瘤组织中的NE含量（n=4只小鼠每组）。

l–n. 经过处理20天后的原位Panc02肿瘤小鼠肿瘤组织中CD80+（l）、CD86+（m）和CD206+（n）巨噬细胞的百分比。数据以平均值±标准差表示（n=6只小鼠每组）。c、e、h、j–n和p中的P值通过单因素方差分析（ANOVA）及随后进行的Tukey多重比较检验确定。

小结

在本研究中，研究者构建了Lar@NP-OMVs，这是一种利用改造过的神经结合肽NP41修饰的外膜囊泡（OMVs），来源于益生菌EcN，并负载了Lar以靶向肿瘤相关神经。Lar@NP-OMVs通过抑制神经营养因子/Trk信号通路直接干扰神经活性。同时，它们有效地将M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）转化为M1型状态，进一步造成神经损伤。因此，Lar@NP-OMVs有效地阻断了神经促进的癌细胞增殖、迁移和血管生成。重要的是，Lar@NP-OMVs显著减轻了胰腺癌中GEM促进的神经发生。Lar@NP-OMVs的组合协同增强了GEM的治疗效果，因而为改善胰腺癌治疗效果提供了一个有前景的途径。