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论文概要
抗生素普遍存在于临床医学和农业生产领域，其中四环素（TC）是使用频繁最高，用途最为广泛的一种抗生素，但由于缺乏全面的管理体系，其对自然环境造成了严重威胁。漆酶是一种以4个金属铜离子为催化中心的多酚氧化酶，可氧化多种底物（酚类、多酚类和苯胺类），但真菌漆酶在工业中常表现出低活性和低稳定性。与真菌漆酶相比，细菌漆酶具有高稳定性并且对极端条件、pH值、盐和有机溶剂具有更强的抵抗力，但决定其稳定性和活性水平的因素仍未完全了解。基于漆酶表面显示的全细胞催化技术可以将酶直接锚定在细胞的外表面，从而消除了酶的裂解释放过程，使酶具有更好的稳定性和活性。但漆酶降解TC在实际应用中仍存在许多问题。因此本文选用2种不同的漆酶通过从蛋白质结构的角度（结构比对、分子对接（包括催化位点分析）和分子动力学模拟）来评估其对TC的去除效果。主要研究结果如下：
（1）选择细菌漆酶CotA和真菌漆酶Lacc6作为构建表面显示的工程菌，3种常见但不同类型的锚定蛋白pGSA、inaXN和estA构建漆酶表面显示系统，通过正交结合，构建了6个表面显示工程细菌（2个漆酶×3个锚定蛋白）并比较其对TC的降解效果，为了避免锚蛋白对靶蛋白的折叠干扰，在两种蛋白之间添加了一种柔性肽（GGGGSGGGGS）（图1A）。其中，以pGSA作为锚定蛋白的系统表现出更高的酶活性，因此，本研究选择pGSA作为漆酶展示的最佳锚定蛋白。酶活性实验结果表明，CotA漆酶重组蛋白的酶活性高于Lacc6漆酶（图1B）。对比两者稳定性发现，细菌漆酶在pH为4-10的范围内保持一定的酶活性（图1C），当pH值为10时，细菌漆酶CotA的3种重组蛋白的相对酶活性均大于53%，而真菌漆酶inaXN-Lacc6的相对酶活性最高仅为37.51%。进一步比较2种工程菌株对四环素的降解能力发现，pGSA-CotA对50
mg/L TC的降解效率为46.08%，而pGSA-Lacc6的降解率仅为13.25%（图1D）。结果表明，与真菌漆酶相比，细菌漆酶对TC表现出更好的降解性能以及更高的pH稳定性。因此，pGSA-CotA是处理TC污染最有效的表面显示体系。![]()
图1 锚定蛋白与漆酶的比较；A）表面显示工程细菌示意图；B）不同pH值下表面显示细菌漆酶活性的比较；C）不同pH值下表面显示漆酶稳定性的比较；D）细菌和真菌漆酶对TC去除效率的比较。
（2）通过对不同pH值下漆酶的聚集倾向分析发现，与细菌漆酶相比，真菌漆酶的疏水相互作用度（DI）显示出更高的自聚集倾向，这可能是因为其存在更多高度暴露的疏水残基，细菌漆酶则保持更稳定且很少聚集（图2A，B）。对CotA和Lacc6进行了50
ns的分子动力学模拟，结果发现，在模拟过程中，Lacc6最大蛋白骨架位移RMSD为0.5 nm（5 Å），而CotA的RMSD值始终小于0.2
nm（2 Å）（图2C）。此外，还评估了漆酶晶体结构的旋转半径（Rg），研究结果发现CotA的旋转半径小于Lacc6（图2D），同时Lacc6的旋转半径出现波动，表明与Lacc6相比，CotA的稳定性更强。分子动力学模拟和分析蛋白质表面电荷分布（蛋白质聚集电位）则可以部分预测或验证漆酶CotA的环境耐受性，这些方法为今后漆酶与其他酶之间的结构和性能比较提供了理论依据。![]()
图2 CotA和Lacc6漆酶的结构稳定性分析；A）不同pH值下漆酶的自凝指数；B）漆酶肽中各氨基酸的活性聚集贡献；C）分子动力学模拟过程中蛋白质骨干位移；D）Lacc6和CotA在分子动力学模拟中的旋转半径值。
（3）利用pGSA-CotA表面显示工程菌对TC进行处理，并测试其在不同条件下的性能。与酶活性结果一致，pGSA-CotA在碱性条件下具有更高的去除效率和稳定性（图3A），当pH值为7时，pGSA-CotA去除TC的效率最好。此外，pGSA-CotA降解TC的效率随着温度的升高而呈现先降低后升高的趋势（图3B）。漆酶CotA是一种典型的铜依赖性漆酶，金属离子可能在酶的活性位点与Cu2+竞争，进一步影响TC的去除效率。因此本文通过将重组蛋白与1 mM金属离子孵育后发现，重组蛋白对重金属表现出相对耐受性（图3C）。在测试的8种金属离子中，除Cu2+外，其余金属离子浓度与酶活性呈反比关系，即金属离子浓度越高，酶活性越低。此外，以TC为降解底物（pH
6.0，25 ℃，50
mg/L），比较了表面显示菌（pGSA-CotA）和细胞内表达菌（intracellular-CotA）的降解效率，结果发现，pGSA-CotA表面显示的大肠杆菌去除四环素效率更高，且可以快速地达到平衡（图3D）。因此，细胞表面展示显示技术不仅加速了功能蛋白在细胞表面的定向反应，而且保证了功能蛋白的酶活性和稳定性。![]()
图5 CotA表面显示菌对TC的去除性能；A）不同pH下TC的相对去除率（蓝色）；在不同pH环境中培养5 h后仍保持漆酶活性（黄色）；B）不同温度下TC的相对去除率（蓝色）；在不同温度下培养5 h后仍保持漆酶活性（黄色）；C）重金属离子对漆酶去除TC的影响；D）CotA细胞内表达菌与表面显示菌对水中TC去除效果的比较。
综上所示，在漆酶表面显示系统脱除TC的构建中，漆酶类型对TC的脱除效率起着决定作用。与真菌漆酶相比，细菌漆酶表面去除TC中表现出较高的稳定性和效率主要归因于细菌漆酶具有结构稳定性好、自聚集性低、配体结合能力弱和包封性强等优点。此外，与传统细胞内表达相比，pGSA-CotA表面显示的细菌对TC的去除速率更快、更彻底以及对各种重金属具有较强的抗性，表明该方法在复杂环境中同样具有较强的实用性。参考文献
Wei
Han, Ying Zhao, Ying Zhang. Laccase surface-display for environmental
tetracycline removal: From structure to function. Chemosphere, 2024, 10(365): 143286.
原文链接
https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2024.143286
通讯作者
张颖，教授，东北农业大学，Email：zhangying_neau@163.com
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