引用本文：孙小涵，赵蕾，周婕妤.益生菌及其衍生物在防治口源性口腔异味中的作用研究进展[J].中国实用口腔科杂志，2024，17（5）：584-590. DOI：10.19538/j.kq.2024.05.014
摘要：口腔异味，又称呼气异味或口臭，是指口腔内呼出令人不悦的气味。临床中80% ~ 90%的口腔异味为口内来源，即口源性口腔异味。与正常人相比，口源性口腔异味患者的口腔微生物群落多样性增加，且厌氧菌比例升高，其与口腔微生态失衡密切相关。益生菌是指当施以足够剂量时，能够给宿主带来益处的活体微生物；益生元、合生元及后生元均为益生菌衍生物，具有重建宿主微生物群落、改善宿主微生态的作用。文章就近年来益生菌及其衍生物在预防和治疗口源性口腔异味中的作用研究进展做一综述。
口腔异味（oral malodor），又称呼气异味（breath malodor）或口臭（halitosis），是指口腔内呼出令人不悦的气味，常给人们的社交活动带来不便，并造成心理压力。流行病学调查显示，由于地区差异和检测方法的不同，口腔异味的患病率为25% ~ 78%［1］，是继龋齿和牙周病后口腔科患者就诊的第三大原因［2］。临床中80% ~ 90%的口腔异味为口内来源，即口源性口腔异味，其发生原因包括舌苔、牙周病、龋病、口腔感染、肿瘤、干燥综合征及黏膜溃疡等［3-11］。造成口腔异味的主要气体成分为挥发性硫化物（volatile sulfur compounds，VSCs），其中硫化氢（H2S）、甲硫醇（CH3SH）和二甲硫醚（C2H6S）被认为是口腔异味的重要检测标志物；此外，挥发性芳香族化合物（如吲哚、粪臭素等）、有机酸（如丁酸、丙酸）及胺类（如尸胺、腐胺）等也可导致口腔异味［3］。人体口腔微生态系统是由多种微生物组成的，稳定的微生态系统可与宿主保持动态平衡，共同维护口腔健康；然而，部分口腔内的细菌，特别是厌氧菌，可产生并释放口腔异味相关气体。与正常人相比，口源性口腔异味患者的口腔微生物系统具有多样性高、厌氧菌比例增加的特点，这提示口源性口腔异味可能与口腔微生态失衡存在关联［4-6］。益生菌是指施以足够剂量时能够给宿主带来益处的活体微生物，益生元、合生元及后生元均为益生菌衍生物［7-8］，其可重建宿主微生物群落、改善宿主微生态，已在胃肠道疾病等治疗中有所应用［9-10］。口腔是消化系统的起始部位，是继肠道之后的第二大微生态系统［7］，益生菌及其衍生物在治疗口腔异味方面的应用逐渐引起关注。本文就口源性口腔异味相关微生态系统和近年来益生菌及其衍生物在预防和治疗口源性口腔异味中的作用研究进展做一综述。
1 口源性口腔异味相关微生态系统
口腔中的微生态系统包括龈上菌斑微生态系统、龈下菌斑微生态系统、舌背微生态系统、颊黏膜微生态系统及修复体表面微生态系统等，不同微生态系统与不同的解剖形态相关，具有不同的生化特征，且其微生物群落的分布与组成也存在差异。其中，与口源性口腔异味相关的微生态系统包括舌背微生态系统、龈上菌斑微生态系统和龈下菌斑微生态系统。1. 1 舌背微生态系统 舌背表面积大，存在较多的不规则结构（如沟裂、舌乳头等），且受到唾液的冲刷作用有限，因而可成为微生物的聚集滞留区［12-13］。有研究显示，舌背黏膜的单个脱落上皮细胞可容纳超过100个单位的细菌，而其他口腔黏膜表面的单个脱落上皮细胞仅能容纳25个单位细菌［13］。此外，舌隐窝深处的氧气浓度低［13］，可为厌氧菌提供有利的定植及生存条件。舌苔是附着在舌背表面的湿润黄白色膜，由脱落的角化上皮细胞、食物残渣及口腔细菌代谢物等组成。多项研究表明，舌苔与口腔异味关系密切，且舌苔中的微生物代谢产生的VSCs是造成口腔异味的主要原因。Zhang等［14］分析了口腔异味组患者的舌苔微生物代谢途径后发现，含硫氨基酸（如半胱氨酸、蛋氨酸）的代谢途径表现出更高的水平；且经过12个月的随访发现，其将含硫氨基酸转化为VSCs的硫代谢途径相较于正常对照组更加活跃，而其他不含硫氨基酸（如色氨酸、精氨酸、脯氨酸和赖氨酸）的代谢途径与正常对照组无显著差异。这些发现表明，口源性口腔异味可能与含蛋氨酸和半胱氨酸的微生物降解产生的挥发性硫化物相关。Carda等［15］和Bernardi等［6］研究发现，舌苔表面积越大、厚度越厚的个体，呼气中的VSCs（H2S和CH3SH）含量越高；且使用16S rRNA测序将口腔异味患者的舌苔微生物群与无口腔异味个体进行比较发现，口腔异味者产生VSCs的微生物（如普雷沃菌属、梭杆菌属和纤毛菌属）所占比例更高，而无口腔异味者口腔共生菌（如副血链球菌、罗氏菌属）的活性更强、占比更高。Ye等［5］研究发现，口腔异味组和正常对照组的舌苔微生物组成存在显著差异，与对照组相比，口腔异味患者的舌苔样本中普雷沃菌属、拟普雷沃菌属、纤毛菌属、消化链球菌属及口腔杆菌属等11个菌属的相对丰度更高；对前50个菌属的相对丰度与VSCs值进行相关性分析发现，普雷沃菌属、消化链球菌属、缠结优杆菌及拟普雷沃菌属均与H2S浓度和CH3SH浓度呈正相关，这表明舌苔微生物群中相关菌属的丰度增加可能是口源性口腔异味的原因之一。由于学龄前儿童鲜有抽烟者，可在一定程度上代表不吸烟人群，且儿童较少存在牙周病、口干或全身性疾病，故可用于研究口腔异味的自然进展及相关微生物组的转变。Zhang等［14］对40名学龄前儿童进行12个月的纵向研究，利用16S rRNA基因测序定期评估其1年内的舌苔微生物组变化，发现口腔异味组的舌苔微生物群结构在口腔异味的临床症状出现之前就与对照组存在显著差异，即微生物群的变化先于口腔异味的发生。另外，产黑普雷沃菌、放线菌作为口腔异味发生预测模型的生物标志物，在后期随访中的预测准确率可达91.7%［14］；这与Ren等［16］研究结果一致，该研究还将普雷沃菌属、消化链球菌属和纤毛菌属定义为口腔异味组舌苔核心微生物群病原体。1. 2 龈下菌斑微生态系统 除来自舌苔的微生物外，龈下菌斑是导致口腔异味的第二大因素［3］，而龈下菌斑中的非附着性菌斑又与牙周炎密切相关。流行病学调查显示，牙周炎患者中口腔异味发生率更高。Song等［17］在韩国年轻人中调查发现，牙周炎患者发生口腔异味的风险是牙周健康人群的1.8倍。Silva等［18］针对巴西年轻人调查发现，牙周炎与非舌苔导致的口腔异味相关，牙周炎患者中自我报告口腔异味的数量较健康人群增加90%。另有研究显示，轻度牙周炎患者中自我报告口腔异味的比例是牙周健康者的2倍［19-20］。牙周炎患者的龈下菌斑生物膜主要为革兰阴性厌氧菌群，具有蛋白水解能力，能够降解含硫底物，释放挥发性硫化物。Izidoro等［19］收集牙周炎患者基础治疗前龈下菌斑样本进行微生物组测序发现，牙周炎患者龈下菌斑中的微生物主要为能产生H2S的具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体及中间普雷沃菌等［21］，而牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体等是CH3SH的主要生产者［3］。Torresyap等［22］使用硫化物探针测量牙周袋内各个位点的硫化物水平，并使用棋盘DNA-DNA杂交确定同一位点的物种水平，结果显示与硫化物阴性部位相比，硫化物阳性位点的菌落形成单位更多，且橙色和红色复合体菌属的含量更高，证实龈下菌斑中的牙周致病菌与口腔异味之间关系密切。牙周炎可促进相关微生物产生VSCs。Alzoman等［23］研究发现，牙周探诊深度≥ 3 mm组的VSCs值均高于对照组（探诊深度< 3 mm）。牙周炎期间牙龈组织充血，血液中的成分（如天冬氨酸转氨酶）可加速VSCs生成［20］。而牙周非手术治疗可改变龈下微生物的组成，进而减少VSCs的产生。Izidoro等［19］比较了牙周炎患者基础治疗前后的龈下菌斑，发现2种橙色复合体细菌（具核梭杆菌、昭和弯曲菌）和1种绿色复合体细菌（牙龈二氧化碳嗜纤维菌）与治疗后VSCs的降低具有强关联性。此外，口腔异味还可通过微生物形成的VSCs对牙周炎产生影响。当暴露于H2S和CH3SH下时，非角化黏膜的渗透性分别增加75%和103%，可促进细菌抗原（如脂多糖）渗透，并诱导炎症产生［24］。VSCs还对上皮细胞产生细胞毒性作用，H2S可引起人牙龈成纤维细胞凋亡和DNA损伤［25］，而硫醇甲酯则抑制口腔上皮细胞的生长和增殖［26］，加速牙周炎发展。1. 3 龈上菌斑微生态系统 龈上菌斑与龈下菌斑不同，其直接暴露于口腔，可受到口腔卫生清洁、唾液冲刷和宿主防御成分等影响。在龈上菌斑微生态系统中，唾液具有维持口腔健康和微生物稳态的作用，其通过调节口腔中的生化反应和对病原微生物的抗菌作用发挥保护效应。健康人群的唾液中澳大利亚链球菌、谭氏普氏菌和罗氏菌为优势菌群，而当口干或唾液分泌不足时唾液中的抗菌成分减少会导致生态失调。Rusthen等［27］发现，干燥综合征患者的口腔微生物群与健康者相比存在显著差异，表现为福赛坦纳菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌和中间普氏菌等产硫细菌增加，且由于唾液冲刷作用减弱，这些细菌可更多地利用食物残渣或其他代谢物中的含硫氨基酸产生大量VSCs。Mummolo等［28］研究表明，长期口呼吸会导致牙齿和口腔黏膜干燥，使得口腔微生物组发生变化（变形链球菌和乳酸杆菌占比更高），增加口腔异味发生率。综上，与口源性口腔异味相关的微生态系统有舌背微生态系统、龈下菌斑微生态系统和龈上菌斑微生态系统等，其均可检测出与健康人群不同的优势菌和菌群比例。目前，口源性口腔异味的经典治疗方案包括使用舌苔刷等机械治疗方法和通过化学疗法进行菌斑控制。然而，由于舌背和龈下存在隐蔽的解剖部位，机械治疗受到限制；辅助使用全身或局部抗菌类药物虽可提高临床疗效，但存在耐药性问题，同时也会扰乱正常的口腔微生物群落。近年来，益生菌及其衍生物在预防和辅助治疗口腔异味中表现出较大的潜力，有望达到重塑有益口腔微生态的目的。
2 益生菌及其衍生物对口源性口腔异味的作用
益生菌及其衍生物有调节和改善宿主微生态的作用，在治疗和预防肠道微生物紊乱的相关疾病（如肠易激综合征、炎症性肠病及腹泻等）中已有所应用。口源性口腔异味与口腔微生态系统失衡相关，已有研究开始发掘益生菌及其衍生物在预防和治疗口腔异味中的可能性。2. 1 益生菌 目前使用较多的益生菌产品中的微生物属为乳杆菌属、双歧杆菌属、酵母菌属、肠球菌属、大肠杆菌属及芽孢杆菌属［29］。益生菌可与病原体竞争黏附点、营养素和生长因子，通过产生乳酸、细菌素和过氧化物等抗菌成分来抑制病原菌的黏附和生长。同时，益生菌可产生针对病原体的免疫反应，刺激宿主免疫系统以增加抗体的产生，抑制炎症介质分泌，以改善口腔黏膜和牙周组织状况。乳杆菌属、唾液链球菌和魏斯菌属是目前防治口腔异味较为有效的益生菌［30］。乳杆菌属可通过产生乳酸来抑制厌氧菌增殖；罗伊乳杆菌对牙龈卟啉单胞菌具有拮抗作用，其可产生罗伊菌素等抗菌物质来降低牙龈卟啉单胞菌的毒力，改变上皮细胞与牙龈卟啉单胞菌之间的相互作用，从而减少病原体的黏附和入侵，并可与牙龈卟啉单胞菌竞争牙龈上皮细胞的结合位点［31］。Salinas-Azuceno等［32］使用罗伊乳杆菌片剂［每片含有1 × 108 CFU罗伊乳杆菌（DSM179381）和1 × 108 CFU罗伊乳杆菌（ATCC PTA 5289）］对慢性牙周炎患者进行单一疗法治疗（每天早晚各吞服1片），1个月后发现龈下微生物群中红色复合体微生物的比例从28.0%下降到5.0%，患者的口腔异味症状明显改善，牙周临床指标（平均探诊深度、平均附着丧失、附着丧失≥ 5 mm位点数及全口探诊出血位点）均有所改善；其中，全口探诊出血位点从74.6%下降到58.0%，改善效果最为明显。有研究应用含有唾液乳杆菌（2 × 109 CFU/粒）和罗伊乳杆菌（2 × 109 CFU/粒）的混合胶囊辅助龈下刮治术及根面平整术（subgingival scaling and root planning，SRP）治疗伴口腔异味的慢性牙周炎患者，嘱患者每次将1粒胶囊溶入10 mL蒸馏水中含漱1 min，2次/d，结果显示与安慰剂组相比，研究组患者1个月和3个月时的口腔异味感官评分明显降低［33］。唾液链球菌是口腔中的常见共生菌，其可产生2种羊毛硫抗生素（唾液分泌素A2和唾液分泌素B），对产生VSC的细菌具有较强的抗菌活性［34］。Yoo等［35］实验结果表明，当唾液链球菌K12和唾液链球菌M18在口腔中的含量高于一定水平时，可抑制牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体，并减少VSC的生成，且这一作用具有益生菌浓度依赖性。由于正畸固定矫治器对口腔卫生具有潜在影响，接受固定矫治的正畸患者口腔中更易定植微生物，其增加了口腔异味的发生率。Benic等［36］对这类口腔异味患者应用含量为3.6 × 109 CFU/片的唾液链球菌片剂（吞服2片/d），1个月后其VSC含量减少了8.5%，安慰剂组减少了6.5%；且3个月后随访发现，安慰剂组VSC含量恢复到基线水平，而益生菌组则进一步下降了10.8%，这提示益生菌对口腔异味治疗具有一定的持久性。另有学者关注了魏斯菌的作用。Han等［37］给韩国大学生每天吞服1片魏斯菌片剂（1 × 108 CFU/片），8周后其口腔中的魏斯菌含量显著高于安慰剂组，且H2S和CH3SH含量显著低于安慰剂组，这表明魏斯菌的有效定植有利于改善口腔异味。Kang等［38］研究发现，摄入魏斯菌可使H2S和CH3SH分别减少48.2%和59.4%，这与Lee等［39］研究结果一致。据报道，魏斯菌可通过产生大量过氧化氢和有机酸来抑制具核梭杆菌的生长，从而降低VSCs浓度［40］。也有研究报道，魏斯菌可显著抑制口腔异味相关微生物（如牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和福赛坦纳菌等）的含量［41］。2. 2 益生元和合生元 益生元是指能够被宿主微生物选择性利用，并带来健康益处的底物，其可选择性刺激一种或一定数量有益菌的生长和活性来为宿主带来益处。益生元是益生菌的特殊培养基，可加强其新陈代谢，并加速菌落发育。与益生菌不同，益生元不含任何微生物，多为食物中的成分，包括天然膳食成分（如淀粉、膳食纤维）或具有促进健康作用的膳食补充剂（如低聚果糖、菊粉、乳果糖及半乳糖衍生物等）［42］。益生元在预防和治疗肠道感染、上呼吸道感染及幽门螺杆菌胃部感染等方面均有显著的临床疗效［43］，而这些疾病的治疗又可缓解非口源性口腔异味的发生。益生元在口源性口腔异味治疗中的报道较少，Rosier等［44］探讨了来自食物的硝酸盐作为益生元在防治口腔异味中的潜力。硝酸盐在口腔中可被还原为亚硝酸盐，并通过反硝化口腔细菌进一步产生一氧化氮；一氧化氮是一种抗菌分子，可限制与口腔异味相关的普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、梭杆菌属、纤毛菌属和异普雷沃菌属的生长。此外，口腔中硝酸盐的反硝化较硫酸盐还原反应更节能，因此，硝酸盐的存在会限制硫酸盐还原，从而减少H2S的产生。目前，益生元在肠道疾病中已被广泛应用；肠道感染的特点是正常肠道微生物群失衡导致病原微生物数量增加，而口腔异味与口腔微生态失衡密不可分，未来益生元在口腔异味治疗中的潜力有待进一步发掘。合生元最初被认为是益生菌和益生元的组合，现在被定义为包含活体微生物和宿主微生物选择性利用底物的混合物，可为宿主带来健康益处。合生元产品中的益生菌会预先利用益生元底物，促进益生菌和益生元在体内的相互作用，并给益生菌带来竞争优势，放大益生菌的治疗效果。Vanholm等［45］研究表明，当补充甘油时，罗伊乳杆菌对牙周致病菌和厌氧共生菌的抗菌能力显著增强，且与甘油剂量呈正相关。Colamarino等［46］发现，菊糖补充剂可使乳酸杆菌和双歧杆菌的相对丰度产生剂量依赖性增加，同时链球菌、梭杆菌、细小单胞菌和普雷沃菌的相对丰度显著降低，这表明菊糖增强了乳酸杆菌和双歧杆菌的抗菌作用。Mousquer等［47］通过感官测试及口气测量仪Halimeter检测VSCs值，发现联合或不联合菊粉应用唾液乳杆菌均可改善口源性口腔异味，但与对照组相比无统计学意义。然而，关于合生元对口腔异味的防治作用及合生元产品中益生菌和益生元的选择和配比仍需进一步研究。2. 3 后生元 国际益生菌和益生元科学协会2021年将后生元定义为无生命的微生物和（或）其成分制剂，可为宿主带来益处［48］。根据定义，后生元通常是益生菌在发酵过程中细胞裂解后分泌到微环境中的混合物，包括代谢物（如有机酸、细菌素、过氧化氢及多肽等）和细胞成分（如细胞壁碎片、细胞质提取物等）。在发酵过程中，益生菌以益生元为食，产生多种后生元［29］。此外，灭活的微生物也是一种后生元。作为无生命体，后生元的功效不依赖于细胞活力，这意味着其可与抗菌药物联合使用且不会失效，其无生命特性，对环境条件不敏感，保质期更长，更耐储存和运输。应用后生元的治疗过程中，没有在微环境中引入新的微生物，而是通过调节宿主体内的固有益生菌菌株来保护有益微生物群，促进宿主微环境稳态。Lin等［49］体外研究将唾液乳杆菌、副干酪乳杆菌及植物乳杆菌发酵产生的后生元分别与口腔致病菌混合液（含牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、放线菌及变异链球菌）共同培养48 ~ 72 h，发现所有后生元均可抑制口腔致病菌活性，抑制率为64% ~ 100%，其中植物乳杆菌的后生元对牙龈卟啉单胞菌活性抑制率可高达100%；将上述后生元混合制成含片（50 mg/g），对初始唾液样本中变异链球菌> 105 CFU/mL的吸烟人群进行临床试验，要求其每日吞服3次，每次4 g，1个月后发现研究组唾液样本中的变异链球菌和伴放线聚集杆菌的菌落显著减少，有益微生物菌株（双歧杆菌和乳酸杆菌）平均增加至初始含量的112%，且IgA含量增加至初始的168%。一些常见的代谢物相关后生元（如有机酸、过氧化氢及细菌素等）具有直接杀菌作用。乳酸菌、双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌产生的后生元有机酸均对革兰阴性菌具有剂量依赖性的抗菌作用［50］。由益生菌分泌的细菌素（如双歧杆菌分泌的双歧杆菌素）对革兰阳性、革兰阴性细菌及某些酵母菌具有广谱杀菌作用［51］，而与口腔异味相关龈下微生态系统中的细菌多数为革兰阴性菌。此外，后生元还可抑制生物膜产生，并解构已经形成的生物膜，防止病原体黏附和聚集。乳杆菌菌株中分离出的脂磷壁酸和无细胞上清液对口腔异味相关病原体（牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌及白色念珠菌）的生物膜形成具有显著抑制作用［52-54］。虽然后生元在治疗口腔异味等方面具有巨大的潜能，但提取相关后生元的技术敏感性、微生物所需达到的灭活程度及相关后生元产品成分配比和选择等使后生元在投入临床应用的过程中仍有较多的限制，需要进一步研究。
口源性口腔异味与口腔微生态系统失衡相关，口源性口腔异味患者的舌苔菌斑、龈下菌斑及龈上菌群等均可检出与健康人群不同的优势菌。益生菌及其衍生物具有重建宿主微生物群落、改善宿主微生态系统的作用；部分益生菌及其衍生物已在口腔异味的临床研究中取得一定效果，但其成熟应用于口腔异味患者的防治中仍存在亟待解决的问题：现有研究对益生菌菌种和菌株的剂量、浓度及疗程等均无明确的标准化方案；合生元的组合成分、比例、剂量及安全性等也尚有许多可探讨的空间；对后生元的提取、纯化、组合配方及其对口腔异味的作用机制了解也较局限，相比于益生菌，后生元在口腔异味的治疗上尚无较成熟的临床产品。仍需进一步的基础及临床研究来探索益生菌及其衍生物的有效性和安全性。
