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文章来源：中华糖尿病杂志, 2024, 16(7): 808-813.
作者：张嘉琪 刘岩 周亚茹
单位：河北医科大学第三医院内分泌科
摘要
糖尿病肾脏病（DKD）是一种常见的糖尿病微血管并发症，也是导致糖尿病患者终末期肾病和死亡的主要原因。DKD的发病机制复杂，目前尚缺乏有效阻止或逆转DKD进展的治疗方法。外泌体是由多种细胞分泌的微小囊泡，可携带多种蛋白质、核酸等生物活性物质。近年研究发现，外泌体可作为载体参与细胞之间的交流，并参与DKD发生发展的过程，且外泌体中的蛋白在DKD的诊断和治疗中发挥着重要作用。该文就外泌体及其蛋白在DKD中的研究进展作一综述。
糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病的主要微血管并发症之一，累及20%~40%的糖尿病患者，已成为全球慢性肾脏病和终末期肾脏病的主要原因 ［ 1 ］ 。目前，DKD的发病机制尚不明确，诊断方法仍存在一定的不确定性和局限性，且现有的治疗方法仅能在一定程度上延缓DKD的发展。因此，深入了解DKD的发生发展机制，寻找更早期的诊断方法和更有效的治疗策略，具有重要的临床意义。外泌体是一种自细胞内分泌到细胞外基质中的膜性囊泡，其中包含的蛋白、脂质和核酸等内容物，具有重要的信息传递作用。近年来，多项研究表明，外泌体及其内容物，特别是外泌体内的多种蛋白，可作为DKD诊断、治疗的重要靶点。本文围绕外泌体及其蛋白的基本特征、外泌体蛋白在DKD发生发展中的作用，以及外泌体及其蛋白在DKD的诊断与治疗中的价值进行综述。
一、外泌体及其蛋白的生物学特征
1983年，Johnstone等学者在绵羊网状细胞培养基的上清液中发现了一类从细胞内分泌到胞外的特殊囊泡，他们把这种囊泡命名为外泌体 ［ 2 ］ 。目前认为，外泌体是细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径在30~200 nm的脂质双分子层膜性囊泡。外泌体可由多种类型的细胞（如上皮细胞、内皮细胞、肥大细胞、淋巴细胞等）释放，其存在于尿液、血液、脑脊液、母乳、羊水、唾液、胆汁等各种体液中 ［ 3 ］ 。
外泌体内含有蛋白、核酸、脂质等多种成分。其中，外泌体蛋白大致可分为以下几类：（1）膜蛋白，如四跨膜蛋白（包括CD9、CD63、CD81、CD82等）；（2）细胞质蛋白，包括溶酶体蛋白、热休克蛋白等；（3）内膜融合/转运蛋白，如膜联蛋白、融合蛋白等；（4）多泡体产生相关蛋白，如TSG101蛋白、Alix蛋白等 ［ 3 ］ 。然而近年来研究表明，上述蛋白在外泌体中已不具有足够的特异性，部分蛋白在外泌体与微囊泡中均存在，如四跨膜蛋白、TSG101蛋白、Alix蛋白等 ［ 4 ］ 。2018年细胞外囊泡研究的最低信息指南（MISEV 2018） ［ 5 ］ 基于生物发生过程及相关细胞器，列举了更具有特异性的外泌体蛋白，包括来源于细胞核的HIST1H、LMNA蛋白，来源于线粒体的IMMT、TOMM20、CYC1蛋白，来源于自噬体和细胞骨架的ACTN1/4、KRT18、ATG9A蛋白，来源于内质网和高尔基体的GOLGA2、CANX、HSP90B1、HSPA5蛋白等，这些蛋白赋予了外泌体的异质性和高度多样性。
二、外泌体蛋白在DKD发生发展中的作用
（一）外泌体与肾脏的纤维增生
转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一种多功能细胞因子，其表达增加可导致组织纤维化，是DKD病变过程中重要的细胞因子。Wang等 ［ 6 ］ 发现，高糖状态可导致肾小球系膜细胞分泌的外泌体中TGF-β1含量增加、通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路，导致肾小球系膜细胞、足细胞损伤以及肾小球纤维化。Wu等 ［ 7 ］ 的研究发现，高糖处理可导致肾小球内皮细胞中TGF-β1表达增多，并诱导肾小球内皮细胞分泌富含TGF-β1的外泌体，后者通过激活TGF-β1/Smad信号通路，促进肾小球系膜细胞中的α平滑肌肌动蛋白表达以及细胞外基质蛋白过量产生，加重肾小球纤维化。肾小球内皮细胞分泌的富含TGF-β1的外泌体还可通过激TGF-β1/Smad通路和Wnt/β-连环蛋白信号通路，促进足细胞发生上皮-间充质转化，导致肾小球滤过率下降 ［ 8 ］ 。Sakurai等 ［ 9 ］ 发现，糖基化终产物可通过激活足细胞TGF-β/Smad3信号通路，促进足细胞分泌含有真核起始因子3（eukaryotic initiation factor 3，Elf3）蛋白的外泌体。Ravindran等 ［ 10 ］ 发现，在高糖条件下，成熟近端肾小管细胞产生的外泌体可通过激活TGF-β相关通路、上皮-间充质转化通路、细胞外信号调节激酶通路等方式，作用于幼稚近端肾小管细胞，促使近端肾小管发生纤维化（ 图1 ）。
图1 高糖环境下肾脏细胞来源的外泌体通过TGF-β参与细胞间通讯诱导DKD发生的机制图。在高糖环境下，肾脏的各种细胞（包括肾小球内皮细胞、肾小球系膜细胞、近端肾小管细胞、足细胞等）分泌富含TGF-β1等内容物的外泌体，通过TGF-β/Smad等多种途径诱导DKD发生发展
（二）外泌体及其蛋白与DKD炎症反应
炎症反应是DKD发生发展的重要环节，包括高糖、氧化应激、活性氧在内的多种因素可导致肾组织细胞损伤，从而触发炎症反应、进一步加重肾损伤。Liu等 ［ 11 ］ 发现，DKD小鼠肾小球中巨噬细胞浸润增加，巨噬细胞来源的外泌体可导致肾小球系膜细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎症小体和其他炎性因子的活化、细胞自噬缺陷和肾小球系膜基质扩张，从而导致肾功能损伤。近年来研究发现，巨噬细胞来源的外泌体是炎症反应与DKD之间的重要桥梁。Zhu等 ［ 12 ］ 的研究表明，在高糖条件下，巨噬细胞来源的外泌体可通过TGF-β1/Smad3信号通路导致肾小球系膜细胞活化、增殖以及炎症因子的过度产生。随后，该团队进行的另一项研究发现，高糖处理的巨噬细胞分泌的外泌体中含有较高水平的诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide sythase，iNOS）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）蛋白 ［ 13 ］ ，后者通过旁分泌或自分泌方式，激活巨噬细胞核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）p65信号通路，促进巨噬细胞增殖以及促炎和促纤维化细胞因子的产生，导致肾脏损伤。
外泌体蛋白也参与了DKD的炎症反应。Liu等 ［ 14 ］ 发现，DKD患者肾组织中内吞衔接蛋白、Delta样蛋白4（Delta-like 4， Dll4）、NOTCH1胞内段（notch1 intracellular domain， N1ICD）等基因所表达的蛋白水平显著升高，并与肾小管间质损伤呈正相关；进一步研究表明，近端小管上皮细胞可分泌富含Dll4蛋白的外泌体，后者可促进M1巨噬细胞激活，该过程受 Epsin1调节。肾脏中的异位脂肪沉积已被证实与DKD存在因果关系 ［ 15 ］ ，Jiang等 ［ 16 ］ 发现，脂毒性诱导的肾小管上皮细胞可释放富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1蛋白的外泌体，后者通过与巨噬细胞TGF-β R1结合，上调巨噬细胞炎症相关基因表达，导致巨噬细胞促炎表型转化，促进肾小管间质炎症，并进一步促进巨噬细胞释放富含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的外泌体，促进了肾小管上皮细胞的凋亡，进一步加重肾小管损伤。
三、外泌体蛋白可作为DKD的生物标志物
（一）尿外泌体蛋白在DKD诊断中的价值
目前，DKD的临床诊断主要基于实验室检查，如尿白蛋白、血清肌酐、估算的肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）等。然而，尿白蛋白极易受各种生理或病理状态的影响，例如肾病综合征、肾小球肾炎、心血管疾病等，因此，尿白蛋白作为DKD的诊断标准并不准确 ［ 17 ］ 。肾脏穿刺活检是DKD诊断的金标准，但是该操作存在出血、感染、取样误差等风险。因此，寻找无创、安全、准确的生物标志物，替代尿白蛋白，对DKD的诊断是必要的。
目前，尿蛋白被广泛应用于DKD的研究。Golea-Secara等 ［ 18 ］ 通过蛋白质组学检测早期2型糖尿病患者和健康人群的尿蛋白发现，载脂蛋白AI、中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白、胞苷脱氨酶、S100-A8和血红蛋白亚基delta这几种尿蛋白成分与早期DKD密切相关。Winiarczyk等 ［ 19 ］ 对糖尿病犬的尿液进行蛋白组学分析，发现相对于无微量白蛋白的尿液，有微量白蛋白的尿液中呈现出与外泌体相关的蛋白组学差异，仅在有微量白蛋白尿糖尿病犬的尿外泌体内检测到锌指蛋白2含量增加，说明尿外泌体及其蛋白可能参与了糖尿病肾脏病早期的病理变化。
尿液中含有丰富的、来源于肾脏、膀胱、前列腺（男性）和子宫-阴道（女性）的外泌体 ［ 20 ］ 。研究发现，尿液中的外泌体，特别是尿外泌体中蛋白，其种类以及含量均不同于尿液中的蛋白 ［ 21 ］ ，故比常规的尿蛋白更能特异地反映DKD的发展，由此为DKD研究提供新思路。2013年，Raimondo等 ［ 22 ］ 对比了伴有微量白蛋白尿的糖尿病肥胖大鼠和非糖尿病非肥胖大鼠的尿外泌体蛋白含量，通过对所鉴别出的286种外泌体蛋白进行分类分析发现，早期DKD与尿外泌体细胞质和细胞骨架蛋白增加有关，为尿外泌体蛋白作为DKD诊断的生物标志物奠定了基础。Gudehithlu等 ［ 23 ］ 发现，DKD患者尿外泌体中的明胶酶和铜蓝蛋白水平与其在肾组织中的变化一致，但尿液中的两种蛋白含量与其在肾组织的变化无关，由此说明，部分尿外泌体中的蛋白可以更好地反映肾脏的疾病状态，可作为无创性生物标志物。
（二）可作为DKD潜在生物标志物的尿外泌体蛋白
随着对外泌体蛋白研究的不断深入，人们发现尿外泌体中多种蛋白能够作为DKD的生物学标志物（ 表1 ）。
2013年，Kalani等 ［ 24 ］ 发现，尿外泌体中的肾母细胞肿瘤蛋白（Wilm′s tumor-1 protein，WT1）可作为早期DKD的生物标志物，与非DKD糖尿病患者和健康对照组相比，DKD患者尿外泌体中WT1蛋白的含量明显升高，与尿白蛋白/肌酐比值、血清肌酐增加以及eGFR下降相关；Abe等 ［ 25 ］ 则发现，肾小球上皮细胞来源的外泌体中的WT1蛋白是一种足细胞损伤的标志物，能够预测eGFR在未来几年的变化。水通道蛋白（aquaporin，AQP）在调节肾脏体液平衡方面发挥作用，Rossi等 ［ 26 ］ 研究表明，尿外泌体中AQP5和AQP2含量与DKD的组织学分级及病情的严重程度呈正相关。此外，DKD患者尿外泌体中Elf3蛋白 ［ 9 ］ 以及CD73蛋白 ［ 27 ］ 的含量增加，均可提示DKD患者肾组织纤维化程度加重。Wen等 ［ 28 ］ 发现，肾小管细胞来源的外泌体中α-烯醇化酶蛋白含量增加与DKD肾间质纤维化的进展有关。早在2005年，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）即被认为是一种早期肾损伤的敏感标志物 ［ 29 ］ 。近年来研究发现，在1型糖尿病早期DKD患者尿外泌体中的NGAL含量明显高于其在尿液样本上清液中的含量，且在无微量白蛋白尿或尿白蛋白/肌酐比值正常的1型糖尿病早期DKD患者中已发现尿外泌体NGAL升高。因此，外泌体内的NAGL可成为监测1型糖尿病早期DKD患者肾小管损伤的生物标志物 ［ 30 ］ 。高糖状态可导致近端肾小管细胞纤维蛋白1（fibulin-1，FBLN1）蛋白表达增加，其分泌的外泌体中FBLN1含量增加，尿外泌体内的FBLN1含量反映了DKD患者近端肾小管损伤的严重程度 ［ 31 ］ 。Li等 ［ 32 ］ 研究发现，在DKD患者尿外泌体中，钙信号通路相关蛋白钙调蛋白-1含量与肾小球滤过率呈负相关、与血清肌酐水平呈正相关。该团队的另一项研究表明 ［ 33 ］ ，肌动蛋白细胞骨架在维持足细胞功能中起着至关重要的作用，而DKD患者尿外泌体中与肌动蛋白细胞骨架调节相关的P21激活激酶6（P21-activated kinases，PAK6）、表皮生长因子受体蛋白的含量同样与血清肌酐水平呈正相关、与肾小球滤过率呈负相关。Ding等 ［ 34 ］ 筛选出371种在DKD患者与其他类型肾病患者中表达差异显著的尿外泌体蛋白，其中含植烷酰辅酶A双加氧酶结构域1蛋白可反映DKD患者的肾功能及血糖控制水平，被认为是鉴别DKD与其他类型肾病最有效的生物标志物。Du等 ［ 17 ］ 发现，尿外泌体中转铁蛋白（transferrin，TF）、serpin 家族成员1（serpin family A member 1，SERPINA1）、α白蛋白（alpha-albumin，AFM）等蛋白的含量均随着DKD的进展而增加，组织蛋白酶D则随着DKD的进展而减少，其中转铁蛋白及AFM蛋白具有在健康人群中预测早期DKD的能力。
四、外泌体及其蛋白在DKD治疗中的作用
（一）干细胞来源的外泌体在DKD治疗中的作用
1.间充质干细胞来源的外泌体（mesenchymal stem cell exosomes，MSC-exos）：近年来研究发现，MSC-exos对DKD具有一定的治疗作用，尤其是人脐带来源的MSC-exos，在DKD中表现出突出的治疗潜力。Cui等 ［ 35 ］ 研究表明，MSC-exos可以抑制高糖饲养的 db/db小鼠近端肾小管上皮细胞的Yes相关蛋白2（Yes kinase-associated protein 2，YAP2）蛋白活化，从而减少肾组织的细胞凋亡并抑制上皮间充质转化。Xiang等 ［ 36 ］ 研究表明，予以DKD大鼠人脐带来源的MSC-exos，可显著改善肾功能，减少肾脏组织炎性细胞浸润以及肾间质纤维化，并降低肾组织中促纤维化因子TGF-β的水平。同时，体外实验表明，人脐带来源的MSC-exos可减少高糖状态下肾小管上皮细胞和肾小球内皮细胞炎性因子水平，并分泌了大量生长因子，如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和血管内皮生长因子。此外，Zhang等 ［ 37 ］ 发现，予以DKD大鼠人脐带来源的MSC-exos治疗，可促进肾脏组织中巨噬细胞从M1转变为M2表型，从而减轻DKD大鼠肾小管扩张、肾小球肥大和硬化、肾间质炎症细胞积聚以及肾间质纤维化。Wang等 ［ 38 ］ 的研究表明，人脐带来源的MSC-exos可抑制DKD小鼠足细胞NLRP3相关信号通路的激活，减少白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎症因子的表达，从而减少足细胞损伤并改善肾损伤。Liu等 ［ 39 ］ 研究表明，骨髓来源的MSC-exos可显著改善DKD大鼠的肾脏组织损伤和细胞凋亡，降低肾组织中炎症因子TNF-α的和NF-κB（p65）表达，还改善肾脏功能。
2.其他干细胞来源的外泌体：人尿源性干细胞外泌体已被证明在DKD治疗方面具有巨大潜力。Jiang等 ［ 40 ］ 研究发现，人尿源性干细胞外泌体可抑制糖尿病大鼠 Caspase-3基因过表达并增加肾小球内皮细胞增殖，同时抑制足细胞和肾小管上皮细胞凋亡，从而减少尿微量白蛋白排泄。随后，Nie等 ［ 41 ］ 进一步研究表明，人尿源性干细胞外泌体可显著抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路的激活，减少大鼠肾细胞的自噬、增加肾组织中轻链3B（light chain 3 beta，LC3B）蛋白表达，减少对肾小球细胞的损伤。脂肪来源的干细胞外泌体在DKD治疗中的机制也与自噬有关，Jin等 ［ 42 ］ 发现，脂肪来源的干细胞外泌体可通过增强miR-486的表达来抑制糖尿病小鼠Smad1/mTOR信号转导，从而增强自噬通量并减少足细胞损伤。此外，Ren等 ［ 43 ］ 研究表明，脂肪来源的干细胞外泌体可靶向作用于序列相似度为129的家族成员B（FAM129B）基因，并调控核因子红系相关因子2（Nrf2）/Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）通路，从而抑制DKD患者高糖诱导的足细胞炎症反应和氧化应激。
（二）外泌体蛋白在DKD治疗效果评估中的作用
近年来的研究发现，外泌体蛋白在DKD的治疗效果评估中发挥一定作用。α-硫辛酸是一种强抗氧化剂，可预防和延缓DKD进展 ［ 44 ］ 。Sun等 ［ 45 ］ 发现，在糖尿病肾损伤早期，尿中CD63阳性外泌体显著增加，给予α-硫辛酸治疗可导致外泌体中CD63的表达显著下降，说明尿外泌体中的CD63可评估α-硫辛酸对DKD的治疗效果。
综上所述，研究表明，外泌体及其蛋白质可作为重要的细胞间信使，参与DKD的发生发展。与传统的DKD诊断标志物相比，来自于尿液的外泌体内的蛋白，作为DKD诊断的新型潜在生物标志物，具有更高的特异性及灵敏度，有望成为DKD无创性早期诊断的新方法。干细胞来源外泌体及蛋白，则在DKD治疗及效果评估中表现出突出的作用，是DKD治疗的新靶点。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
参考文献略
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