JACS：很实用，一种可用于大型化合物库Cys靶向亲电弹头探索的可塑性竞争性策略

学术 2024-11-25 08:25 上海

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2024. Nov.14

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学以致用侃侃而言 :半胱氨酸靶向共价探头分析方法

DOI: 10.1021/jacs.4c05711

半胱氨酸（Cys）反应性共价弹头是共价药物和分子探针的设计中的"台柱子”，当前已经取得了不俗的成绩，然而，关于新的探索仍然是研发中的重点之一。尤其是当前共价抑制剂的发展已经是通过筛选具有亲电弹头的大型化合物库，以“亲电性优先“的设计、开发阶段，对于Cys反应性共价弹头的探索也是开发的重点。

近日，J Am Chem Soc上刊载了一篇非常实用性的研究性文章，报道了一种可塑性巯基反应性（STRP）方法，可与共价化合物竞争性与Cys反应，以比较灵敏的荧光检测做显示分析，非常便捷的探索大型化合物库与Cys残基的固有反应性。在实际的应用中，成功鉴定出一种新型Cys共价弹头：氮杂啶噁二唑，基于开环机制，选择性与Cys残基反应。

主要内容

可塑性巯基反应性分析的发展一种竞争性Cys残基反应性基团检测方法

高通量筛选Cys反应性基团应用：新型Cys共价弹头，噁二唑氮杂啶

总结与展望
及往期相关精彩回顾

part.1

巯基反应性分析

竞争性检测Cys反应性试剂

半胱氨酸（Cys）残基相比于其它蛋白原氨基酸，其固有的亲核性，使其成为共价基团靶向的重要位点，在靶向药物、分子探针、交联剂和偶联剂等研究中起到重要作用。而探索Cys反应性化学片段也成为这些研发项目中的一大热点。

然而，除少数例外，当前FDA获批的药物中，Cys活性基团的适用很大程度上仅限于丙烯酰胺，探索高效、新型Cys共价弹头非常必要。

在共价小分子抑制剂的开发中，除了偶然发现，合理性设计多是以“亲和性优先”，先通过药化努力，优化获得高亲和力的非共价结合剂，再根据了解的结构信息，在合适的位置附加有限数量的“亲电弹头”以赋予这些亲和元件共价性。

近年来，利用化学蛋白质组学的无偏倚方法发现共价配体，使用多种亲电探索片段，广泛筛选细胞蛋白质组，以“亲电反应性优先”的方法扩大了可药物蛋白质组的范围，同时也颠倒了化学共价抑制剂发现的操作顺序，尤其是通过共价化合物库的直接高通量筛选。

然而，用于探索大型化合物库（分子数超过10³以上）与Cys的反应活性的检测多是基于LC-MS或比色法，它们的可塑性和灵敏度都有限，这不利于高通量Cys共价弹头的探索。

本文就介绍了一种高灵敏度、高通量的策略，用以探索高通量化合物文库中与Cys反应性的亲电试剂：可塑性巯基反应性分析（STRP）试验。

这个检测策略启发于萤火虫荧光素：如下图A/B，D/L-半胱氨酸可与2-氰基-6-羟基苯并噻唑（CHBT）反应，生成D/L-萤火虫荧光素；而这种荧光素在它同源荧光素酶的作用下被氧化而发光。这种可塑性发光能力已经被广泛用于多种可塑性生物试验之中。

图片源自JACS.

受此启发，研究人员开发了一种竞争性试验，用以检测小分子与Cys的反应性活性，如上图。测试化合物首先与Cys共存，随后加入CHBT分子；具有Cys反应性的测试化合物消耗了Cys，无萤火虫荧光素产生，当加入荧光素酶时，不发光；没有Cys反应性的测试化合物组有可与CHBT反应的Cys，进而生成了萤火虫荧光素，在后续荧光素酶氧化下，发光。

因此，通过检测最终样品是否能够被荧光素酶诱导发光可知：发光，则测试化合物不具有Cys反应性（也可能是反应性不够？）；不发光，则测试化合物具有Cys反应性。

STRP竞争性检测方法如下流程图所示，共分为三步：

图片源自JACS.

步骤1：在多孔板的每孔中分别加入需要检测的化合物和D-Cys，室温共存孵育3小时（1.5-250 μM，TRIS缓冲液中）；

步骤2：每孔中加入适量CHBT，孵育30分钟，使没有Cys活性的样品孔内形成功能性荧光素；

步骤3：每孔中加入ATP-Mg²⁺和荧光素酶，使形成的萤火虫荧光素氧化发光而被检测到；低信号代表Cys活性化合物、高信号代表非Cys活性化合物。

通过探索，研究人员确定了D-Cys（1~10,000μM）、CHBT（1~1,000μM）、和荧光素（0.1~1,000μM）在实验条件下的可适用范围，最终产生的荧光信号的动态范围超过背景的10⁴倍，如下图。值得注意的是，在筛选化合物的典型浓度区间（1~10μM），D-Cys的浓度可进行化学计量竞争，方便于应用。

图片源自JACS.

此外，研究人员还开发了对照试验检测，测试给定的Hit化合物是否可能通过与半胱氨酸反应以外的某种机制降低发光信号，如下图。对原有的操作顺序进行调整：顺序是D-Cys与CHBT孵育，形成D-荧光素；随后加入测试化合物、荧光素酶暴露、进行发光记录。在对照试验中降低发光信号的化合物可能是荧光素酶的抑制剂，或者该试验的非特异性调节剂，如聚集物。

图片源自JACS.

接下来，研究人员选择了文献报道的12种已知的Cys反应性试剂（下图B），作为一个“训练集”，对上述STRP分析试验进行准确性、和剂量依赖性测试。

图片源自JACS.

如上图B/C，结果表明，这12种试剂在STRP试验中：

(1) 均能剂量依赖性地抑制发光信号;

(2) 该分析可以准确预测两个具有既定反应性的相似分子中哪一个更具有反应性；如上图B/C中，富马酸二甲酯（化合物3）比富马酸单甲酯（化合物4）更具有效（分别为13.4μM、15.4μM）；碘乙酰胺（化合物10）比氯乙酰胺（化合物9）更有效（20.7μM、114.7μM）。

在对照试验中，仅有两个分子，化合物1和2在浓度小于250μM时显示出任何抑制活性，并且其IC₅₀明显高于STRP试验。

总的说来，这些数据表明，STRP分析可以报告不同浓度范围内的各种亲电化学物质的半胱氨酸反应性。

应用于高通量筛选

part.2

新型Cys弹头噁二唑氮杂啶

2.1、高通量筛选：噁二唑氮杂啶弹头初发现

研究人员利用STRP分析策略对一个包含10,561个小分子的商业库进行高通量筛选，检测SRTP抑制活性。此外，这些小分子大部分缺乏常见的亲电试剂，如丙烯酰胺、氯乙酰胺等。筛选结果如下图A。

噁二唑氮杂啶弹头初发现：可以看出，红色标记的一系列氮杂啶类化合物（11个）发光信号很低，可能具有潜在的Cys反应活性。其中三个相关化合物如下图B，都含有噁二唑氮杂啶片段。

图片源自JACS.

如上图C、D，三个化合物在STRP试验中具有剂量依赖性反应性抑制活性，而在对照试验中均未显示出抑制活性。

Cys反应性机理：通过分析和试验验证，利用Boc2O酸酐捕获了噁二唑氮杂啶与Cys反应产物，如上图E。通过NMR鉴定（上图F），确定这类活性化合物与Cys反应是一种开环加成反应。

氨基酸选择性：此外，研究人员利用化合物15，对更多的具有亲核性残基的蛋白原氨基酸进行验证，如半胱氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、和酪氨酸，仅有半胱氨酸（Cys）显示出与化合物15体外的反应产物，如上图G。

SAR研究，探究更广泛的氮杂啶类似物：研究人员又从24个商售的C3取代氮杂啶片段进行Cys反应性活性验证，仅发现其中3个（17、35、39）保留了一定的反应活性，如下图。其中，化合物39同样包含又噁二唑片段。

图片源自JACS

研究人员将化合物15与另一个不具有SRTP反应抑制活性的咪唑取代氮杂啶化合物19进行基于密度泛函理论（DFT）的计算，以获得噁二唑取代增加氮杂啶Cys反应性的潜在机制，如下图。

图片源自JACS

噁二唑有利氮杂啶开环的机理：如上图，研究人员认为氮杂啶开环反应是通过硫醇盐的协同S_N2-样反应进攻氮杂啶环上的2-位碳而进行的。对比可知，化合物15的过渡态（A1-TS）比化合物19的过渡态（B1-TS）具有较低的能垒。而通过晶体结构可知，化合物15达到过渡态所需能量降低，是由于氮杂啶片段与噁二唑片段形成有利的分子内氢键相互作用，以及噁二唑的自然键轨道（NBO）对氮杂啶碳具有有利的NBO电荷。

2.2、氮杂噁二唑广泛参与整个蛋白质族的Cys靶向

体外试验获得了成功，那么，在活细胞中，针对蛋白质组的半胱氨酸残基，噁二唑氮杂啶弹头的共价配体作用如何呢？

研究人员合成了化合物15的类似物，化合物41，在苯基芳环的对位以末端炔烃取代，用以连接亲和标签和富集研究，如下图A/B，化合物41在STRP中抑制活性与化合物15近似（34μM VS 45 μM），并在对照实验中没有活性。

图片源自JACS

上图C，在HEK293T细胞暴露于化合物41，显示化合物41仅标记活细胞中的Cys残基。

上图D，通过链霉亲和素富集和AP-MS/MS蛋白质组学分析相结合，鉴定出546个蛋白质在这些条件下具有统计学上的富集。

上图E，表明了约81%的蛋白靶标还没有药物化。

上图F，这配体蛋白对应于一系列蛋白质功能类别，如转运蛋白、酶、伴侣蛋白等。

上图G，其中一些特殊的蛋白类别，如RNA结合蛋白、泛素偶联机制和异构肽水解酶等。这些类别在最富集的蛋白质中非常具有代表性，如E3连接酶、半胱氨酸蛋白水解酶、和RNA结合物（图D）。

研究人员重点放在了两个高度富集的E3连接酶上：UBR7（泛素蛋白连接酶n-识别蛋白7）、UBE2O（泛素偶联酶E2 O）；以及两种高度富集的去泛素酶：USP11（泛素特异性肽酶11）、和UCHL1（泛素C-端水解酶L1）。

研究发现，适度的化合物41浓度（20μM），上述4种在细胞中过表达蛋白均可被强烈标记。

这些数据表明，噁二唑氮杂啶可以共价标记Cys蛋白质组的大部分，靶向许多尚未用小分子配体给药的蛋白质。

通过上图中H、I、J中的对比，表明，噁二唑氮杂啶于蛋白质组中相当独立的一类Cys结合，其反应性与其它亲电基团相当不一致。

2.3、应用：UCHL1激活子的发现

最后，研究人员通过表征含噁二唑氮杂啶片段的化合物可以调节共价配体修饰蛋白功能机制，来鉴定反应性基团的适用性。如化合物41与UCHL1的相互作用。UCHL1是一种硫醇肽酶，它从蛋白中切割C端结合的泛素分子，对维持神经细胞群至关重要。

化合物41可以在HEK293T细胞中，对过表达的FLAG标记的UCHL1靶标，以剂量依赖的方式共价标记。如下图A，将Flag标记的转基因C90或C125突变为丝氨酸或丙氨酸，只有在C152突变的情况下才取消标记。

下图B中显示，可以通过MS/MS检测到含有C152的打开的色氨酸加合物片段。

图片源自JACS

上图C中，可以看出UCHL1具有一个“交叉环”，在其运动时，可以进入蛋白质底物的活性位点。而C152就占据在活性位点交叉环的中间位置。这表明它的修饰可能会调节蛋白质的催化活性。

上图D中，增加化合物41浓度，反应效率将近增加了2倍（EC₅₀=6.6μM）。

上图E中，研究还发现，从HEK293T细胞中分离出的化合物41（10μM）原位标记的Flag标记蛋白也显出增加的反应速率，不过程度较低。

上图F、G中，研究发现，化合物41对HEK293T细胞的处理，增加了myc标记的UCHL1进一步去泛素化Flag标记的SMAD2和ALK5的能力。

这些数据表明化合物41对C152的共价修饰在功能上增加了体外和细胞内UCHL1的异肽酶活性。

part.3

总结与展望

本文介绍的一种简单、便捷的可塑性Cys检测方法，用于小分子与Cys的内在反应性检测非常灵敏、准确。利用STRP分析，能够对Cys反应性进行无偏倚评估，准确地报告已知的Cys反应性亲电试剂在几种反应类型中的共价反应，如S_NAr、Michael加成等。并且，这种检测策略适用于几个数量级的反应物浓度，产生可测量的发光信号，即使是弱的Cys反应活性分子，可能被适当地检测出来。对于高通量文库（如~10⁴级）的Cys反应性确定非常便利。

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