通过代谢工程改造的微生物菌株能够高效的合成有价值的产品，然而在某些途径环境中，要求在不同时间对工程菌株的不同代谢模块进行控制，以实现在不破坏细胞稳态的同时将细胞生长与产品合成分离。故需要建立先进的基因回路，以便在不同的发酵时期有序地控制代谢模块。已有的多模块控制系统存在一定限制，例如需要依赖能够响应特定代谢物的天然生物传感器，或者需要使用昂贵的诱导剂等等。
因此，该研究通过结合热传感器和CRISPRi，创建了用于多模块有序控制代谢的新型可编程温度响应基因回路，并使用创制的元件对2’-FL的生产进行多模块有序控制，最终在5L发酵罐中合成了28.2g/L的2’-FL。
正交温度响应生物传感器的设计
由于枯草芽孢杆菌缺乏可用的温度响应转录因子，该研究首先选择了噬菌体lambda的热敏转录因子CI857及其相应的启动子PR作为传感器设计的组件。转录因子CI857会在温度较低时与PR启动子的两个操纵子位点(OR)结合阻止转录。相反，温度较高时，CI857的DNA结合活性被消除，使得PR启动子能够与RNA聚合酶结合正常开启转录。
该研究首先验证了该转录因子在枯草芽孢杆菌中的性能。然而，观察到启动子PR可以在39℃下启动转录，在42℃时动态范围为2.4，表明性能较差，需要改进。作者选择将PR启动子的两个OR以不同组合插入组成型强启动子Pveg的不同位置，构建了五个不同的Pveg衍生启动子，验证了他们的性能并得到了一个较好的启动子Pveg5。为了得到不同转变点的启动子，该研究进一步改造Pveg5，通过将两个OR突变得到了一系列启动子Pveg5突变体。通过高通量筛选最终获得了具有不同转变点的温度响应启动子变体Pveg30、Pveg32、Pveg34、Pveg37。
图1 正交温度响应生物传感器的构建和表征
枯草芽孢杆菌中温度响应基因回路的构建
该研究基于上一节的温度响应启动子设计并构建了单输入多输出(SIMO)回路，将三种不同的报告蛋白基因分别置于Pveg32、Pveg34、Pveg37的控制下，通过改变单一条件(温度)，该回路可以同时控制三个基因的表达强度。随着温度的升高，CFP、GFP和mCherry模块在发酵过程中有序且独立地表达。结果表明，该回路能够通过温度输入对多个模块的表达水平进行有序控制。
由于上述回路仅能实现基因激活，为了实现激活和抑制的双功能调控，该研究通过构建一个非门来实现抑制功能：该研究借助CRISPRi系统，通过修改crRNA使用无活性的Cpf1 (dCpf1)蛋白抑制不同的靶基因。dCpf1(crRNAP43)的表达由启动子Pveg5驱动，mCherry由P43的强组成性启动子控制，作为报告基因来测试性能。结果显示，该回路成功反转了响应信号，随着温度升高，报告基因的表达受到抑制。
图2 单输入多输出回路的特征
图3 双功能温度响应回路的特征
具有多模块有序控制的工程化2’-FL合成途径
为了验证温度响应基因回路是否可用于控制细胞代谢，该研究在枯草芽孢杆菌中构建了2’-FL的从头生物合成途径。对来自大肠杆菌的四个基因（包括manB、manC、gmd 和 wcaG）以及来自幽门螺杆菌的基因 futC 进行了密码子优化，并将其整合到枯草芽孢杆菌基因组中，在组成型启动子P43的控制下，得到菌株MT1。随后，将manB或futC置于温控启动子Pveg34下验证温控开关对产量的影响。得到的菌株MT3在变温条件下(0-12小时30℃和12-60 小时37℃)相比恒温条件下(0-60小时37℃)，不仅生物量提高了，同时产量也急剧增加(159.5%)至 755 mg/L。
随后，该研究将温控抑制系统用于控制生长相关途径(2’-FL合成支路)，包括磷酸戊糖途径的zwf1和糖酵解途径的pfkA。该抑制回路由组成型启动子Pveg控制的dCpf1和由温度响应启动子 Pveg5 控制的crRNA组成。分别设计针对zwf和pkfA编码区起始、中部和末端的RNA设计了多个crRNA，并组装为9种组合(MT6-MT15)，经过有序控制培养(0-12小时30℃、12-18 小时34℃和18-60小时37℃)验证后，结果显示菌株MT9在60小时时OD600为26.5，该菌株2’-FL滴度最高(1399.5mg/L)，与对照菌株MT3相比增加了85.4%。
该研究进一步将温控激活系统用于控制2’-FL合成途径以及GDP-L-岩藻糖的生物合成。将gmk、ndk和xpt三个基因置于启动子 Pveg34 控制下，以同时激活GTP 和 2’-FL 合成模块。过表达ndk和gmk的菌株MT17最终2’-FL总滴度为1839.7mg/L，相比MT9增加了31.5%。由于观察到工程菌株出现了自融，该研究使用抑制系统控制lytC构建了菌株MT22，结果表明，虽然菌株生物量有所提高，其最终2’-FL滴度低于MT17。
图4 2’-岩藻糖基乳糖生物合成的动态调节
图5 通过有序控制竞争途径和增强GTP供应提高2’-岩藻糖基乳糖的产量
5 L发酵罐中2’-FL的生产
该研究将MT17和MT22在5 L发酵罐中扩大培养并验证时序控制系统的性能，并使用qPCR测量了MT17和MT22在不同发酵时期控制基因的相对转录水平(见图6)。结果表明，温度响应回路在5 L发酵罐中表现良好。最终，菌株MT17的2’-FL滴度为20.6g/L，菌株MT22的2’-FL滴度为28.2g/L。
图6 多模块有序控制下菌株MT22中基因表达情况
图7 在多模块有序控制下，5L发酵罐中的2’-FL产量
原文链接：
https://academic.oup.com/nar/article/50/11/6587/6603658
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摘译 | 赵逸飞
编辑 | 王咏桐
左莎莎
陈嘉序
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