美国格拉斯哥大学病毒研究中心：作为急性虫媒病毒感染模型的蓝舌病疾病严重程度的相关性

2024年8月16日，美国格拉斯哥大学病毒研究中心在PLOS PATHOGENS在线发表了题为“Correlates of disease severity in bluetongue as a model of acute arbovirus infection”的最新研究成果。该研究旨在通过使用自然发生的蓝舌病作为急性虫媒病毒感染的模型，来揭示病毒与宿主相互作用的基本机制，以及这些相互作用如何导致不同的临床结果。

这一实验结果表明，病毒能够迅速适应由单个氨基酸缺失引起的宿主抗性。在这项研究中，我们通过实验感染绵羊，使用了三种不同的蓝舌病毒（BTV）株：BTV-1IT2006、BTV-1IT2013和BTV-8FR2017，以研究急性虫媒病毒感染的病理机制。我们选择这三种病毒是因为它们与蓝舌病的野外爆发相关，并且具有不同的临床表现：BTV-1IT2006引起严重的临床疾病，BTV-8FR2017导致不明显或轻微的疾病，而感染BTV-1IT2013的绵羊表现出中间型表型。我们尽可能在实验模型中保持“自然”条件，直接从感染动物的血液中分离这些病毒，并在库蠓细胞系中不超过三次传代，以最小化细胞培养适应引起的突变。我们通过皮内注射感染了萨德羊，模拟昆虫叮咬。在两个不同的地点进行了动物实验，使用公羊（地点1）或母羊（地点2）。每个动物实验组将用“G1”或“G2”表示实验地点，后跟用于实验感染的病毒。例如，地点1中感染BTV-1IT2013的羊群被定义为“G1-BTV-1-2013”。感染动物观察了7天，对应于临床症状的高峰（G1-BTV-1-2013除外，它们被保留了21天）。我们每组使用了7只动物，并在每个地点包括了一个模拟感染的对照组（匹配年龄、品种和性别）。每天记录体温和临床症状，并编制成临床评分。尽管临床评分（发热除外）主要基于视觉检查，这可能难以清晰区分中间表型，但G1中的公羊通常显示出比G2更高的临床评分、更高的发热和更严重的临床表现。G1-BTV-1-2006动物表现出最严重的临床症状；G2-BTV-8显示出最轻微的结果，而感染BTV-1IT2013的绵羊表现出中间表型。总体而言，我们能够实验性地再现在野外描述的临床结果。感染BTV-1IT2006的绵羊以严重的皮下水肿（图1a）和急性呼吸症状为特征，表现为呼吸急促、鼻孔溃疡和侵蚀（图1b），相对于对照动物（图1c），以及包括高热在内的严重全身感染迹象。感染BTV-1IT2006的母羊与感染BTV-1IT2006的公羊相比，显示出较轻的疾病结果和较低的直肠温度（图1d-1f）。为了确认这种明显的性别偏好，我们在地点G2额外实验性地感染了三只公羊与BTV-1IT2006（S1图）。总的来说，感染羊的直肠温度在感染后6至7天达到高峰（图1d和1e）。在地点G2感染BTV-1IT2006的公羊比雌性动物表现出更严重的临床疾病。

图1.实验诱导的蓝舌病不同的临床表型

2.机器学习方法识别疾病严重程度的相关性

在这项研究中，我们从实验感染和对照组的绵羊身上收集了血液样本（在感染后的第0、1、3和7天），并在7天时收集了多种组织样本进行分析，包括全血转录组、血清细胞因子、血液生化、病毒血症和血清学。此外，我们还使用定量免疫组化技术评估了BTV抗原（NS2）在组织中的分布，并评估了引流接种部位的淋巴结中的滤泡数量以及T细胞和B细胞（包括Foxp3调节性T细胞）。通过整合基因集（BTMs）分析动物组之间的全血转录组，我们收集了总共332个参数，并建立了一个监督式机器学习方法，旨在识别病毒病理学和疾病结果的临床轨迹的相关性。我们使用随机森林机器学习方法分析了不同分组的数据，并通过递归特征消除找到了区分每个组的最具有预测性的核心参数子集。通过1000轮交叉验证，我们发现四个感染状态（G2-BTV-1-2006、G2-BTV-8、G1-BTV-1-2006和G2-control）的识别准确度超过了98%。此外，我们还使用了Boruta算法来确认随机森林方法的结果，并通过在打乱的数据表上训练随机森林来进一步证实我们的机器学习结果的稳健性，而不是简单地过拟合背景噪声。

图2.疾病严重程度预测相关性的核心子集的选择

3.区分蓝舌病临床轨迹的关键过程

接下来，我们将研究重点放在具有最高基尼重要性值的参数上，这些参数是上述三个分组中至少两个分组的常见预测因子。这种无偏方法总共识别了35个参数，其中8个参数被所有3种方法共享。总体而言，从这些参数中，我们确定了影响蓝舌病临床轨迹的病毒与宿主相互作用中的五个不同基本过程：（i）病毒载量，（ii）宿主I型干扰素（干扰素）反应;（iii）促炎反应，（iv）血管损伤，和（v）免疫抑制。

4.目标器官中的病毒载量和复制

在这项研究中，我们发现血液中的病毒血症（血液中的病毒RNA量）是机器学习方法识别的对疾病严重程度影响最大的参数。从感染后第1天（dpi）开始，我们就在一些感染动物的血液中检测到病毒RNA，到第3天，除了G2-BTV-8组外，大多数感染动物的血液中都检测到了病毒RNA。到第7天，除了4只感染BTV-8的羊和对照组外，所有动物都出现了病毒血症。重要的是，在G1-BTV1-2006组中，那些临床表现最严重的动物在第7天的血液中检测到的病毒RNA值最高，这突显了病毒血症与临床症状严重程度之间的正相关性。

此外，我们通过免疫组化定量检测了感染动物在第7天的组织中病毒抗原的相对量，这也是区分临床结果的35个关键参数之一。我们评估了BTV在感染动物组织的复制情况，通过软件辅助的无偏图像分析技术，对舌头、肺部、皮肤（病毒接种部位和远端部位）以及引流接种部位的淋巴结的染色组织进行了分析。通常，BTV感染动物的舌头和肺部显示出最高的病毒蛋白表达相对值。这些器官的损伤与绵羊蓝舌病的主要临床症状一致，包括舌头的损伤和呼吸窘迫。我们在舌头的内皮细胞中通过免疫组化和RNA原位杂交分别检测到了BTV抗原和RNA。在肺部，支气管和肺泡上皮细胞对病毒抗原呈阳性。在BTV感染动物中，G1-BTV-1-2016组在第7天显示出比其他组更高的病毒感染细胞比例。我们发现病毒存在于皮肤接种部位的小血管内皮细胞中，以及在远端区域。这些数据表明，病毒在病毒血症阶段感染了深真皮层的内皮细胞。然而，通过共聚焦显微镜分析，在早期时间点（2 dpi）从感染BTV-1IT2006的动物中收集的额外皮肤样本（包含在另一项试点实验中）显示，BTV主要感染淋巴管的内皮细胞。

图3.定义蓝舌病临床结局的关键参数

图4.病毒在受感染动物的血液和组织中复制

5.I型干扰素反应的时间

在这项研究中，我们发现I型干扰素（IFN）反应相关基因的表达是影响蓝舌病疾病结果的关键因素。通过分析感染动物的血液转录组，我们确定了与I型IFN反应相关的基因，如IRF-7、CXCL10、ISG15、IFIT-1、IFIT-2、RSAD2和OAS1等。我们进一步分析了感染早期至临床症状高峰期（1至7天）的干扰素刺激基因（ISGs）的表达，以捕捉IFN反应的时间调控。感染BTV-8（表现为非常轻微至无症状感染）的动物在感染后第1天显示出最强的ISGs早期上调。相比之下，临床症状严重的G1-BTV-1-2006组的绵羊在感染后第1天未显示出ISGs的上调，而感染BTV-1IT2013的动物（表现为中间型表型）则显示出轻微的ISGs上调。在感染后第3天和第7天，G1-BTV-1-2006组的绵羊显示出最强的ISGs诱导，而G2-BTV-8组的动物则最小。这些数据表明，较不致病的BTV-8FR2017在感染后早期被宿主I型IFN反应控制，而更具致病性的BTV-1IT2006能够阻断早期的IFN反应。我们还通过体外感染绵羊内皮细胞并分析6和12小时后的ISG反应来证实这些数据，发现BTV-1IT2006在感染早期诱导的ISG反应相对较低，这表明这种更具致病性的病毒更擅长调节IFN反应。

图5.ISG上调的早期调节与疾病严重程度相关

6.促炎症反应导致血管损伤

在这项研究中，我们发现与宿主促炎反应相关的三个参数具有最高的基尼重要性值。其中，BTM 86.1是第三高基尼重要性值的参数，包括许多促炎介质，如IFNγ、TNF、CCL4、CCL20和NFKB1。与G2-BTV-8组和模拟感染对照组相比，病情更严重的绵羊中这个BTM的上调更为显著。通过Luminex分析确认了RNA测序数据，显示在临床症状更严重和中等严重的绵羊血清中，包括IFN-γ和CXCL10/IP-10在内的细胞因子显著上调。此外，与先天免疫反应和促炎介质（如IL1β）相关的其他BTMs也被列为35个关键预测参数之一。总体而言，RNA测序和Luminex分析的数据均表明，疾病严重程度与促炎细胞因子的诱导密切相关。

血液中促炎介质的存在可能导致血管损伤。相应地，BTV疾病严重程度的第六个预测参数是感染动物血液中检测到的总蛋白量。病情严重的蓝舌病动物显示血液中总蛋白的显著丢失，这是血管损伤的结果。此外，在严重蓝舌病病例（G1-BTV-1-2006）中，与血小板激活相关的基因（BTM M196）也显著上调。RNA测序通路分析也证实，在病情严重的绵羊中，与血管疾病相关的基因上调更为显著。这些发现表明，疾病严重程度与促炎反应和血管损伤之间存在紧密联系。

7.免疫抑制

在这项研究中，我们发现与B细胞表面标志物相关的BTM S8是具有最高基尼重要性的参数之一，且在病情更严重的绵羊中这种BTM的表达减少。此外，与B细胞富集相关的另外两个BTM（BTM M47.3和BTM M47.4）也在35个关键参数中被识别出来，这表明在严重疾病动物中B细胞有减少的趋势。这些数据与先前发表的报告一致，显示BTV感染会导致淋巴细胞减少症和由于滤泡树突细胞感染导致的生发中心B细胞分裂抑制而引起的暂时性免疫抑制。实际上，我们在病情严重的动物中检测到引流病毒接种部位的淋巴结中滤泡数量减少。我们还证实了与对照动物相比，G1-BTV-1-2006动物存在淋巴细胞减少症，尽管由于物流原因我们无法在G2组动物中进行这一特定实验。重要的是，我们发现与T细胞激活相关的基因相关的BTM 7.3在没有（G2-BTV-8）或病情中等的动物中显著上调，而与病情严重的（G1-BTV-1-2006）相比则相反。此外，我们进一步分析了调节性T细胞（Treg），因为它们是调节抗病毒免疫的关键驱动因素。我们在G1-BTV-1-2006动物的淋巴结中检测到与BTV-8FR2017和BTV-1IT2013感染的动物相比，Foxp3+ Treg显著减少。严重疾病动物中Treg的减少表明这一T细胞亚群在BTV病理发生结果中扮演重要角色，已知它们可以控制病毒引起的组织损伤并抑制过度的免疫反应。总体而言，RNA测序通路分析也证实了免疫抑制，显示G1-BTV-1-2006中差异基因表达的水平显著更高。

图6.促炎症反应的程度、蛋白质损失和淋巴细胞减少与疾病严重程度相关

图7.蓝舌病发病机制关键发病机制的示意图

在本研究中，我们通过实验感染绵羊并使用机器学习方法，揭示了蓝舌病（BTV）感染严重程度的关键决定因素。我们发现病毒血症、I型干扰素（IFN）反应的时机、促炎细胞因子的诱导以及免疫抑制与疾病的严重程度密切相关。特别是，病毒在绵羊体内的复制水平、早期IFN反应的抑制、以及随后的促炎反应，共同影响了蓝舌病的临床表现。

我们的研究结果强调了BTV感染中免疫调节的重要性，特别是B细胞和调节性T细胞（Treg）在疾病进程中的作用。病情较重的动物表现出B细胞减少和Treg细胞数量降低，这可能与病毒诱导的免疫抑制和组织损伤的加剧有关。这些发现为理解蓝舌病的病理机制提供了新的视角，并可能有助于开发新的预防和治疗策略。

总体而言，我们的研究不仅增进了对蓝舌病复杂病理过程的理解，而且为其他虫媒病毒疾病的研究提供了宝贵的参考。通过深入分析病毒与宿主之间的相互作用，我们可以更好地预测疾病的临床结果，并为未来的疫苗设计和抗病毒治疗提供科学依据。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012466

校对：Collin

投稿合作：shouyiyanquan@163.com

可为课题组代发文章宣传、新闻通稿、招聘等