PNAS丨大连化物所周雍进团队在毕赤酵母中将甲醇生物转化用于生产脂肪酸衍生物

甲醇被认为是化学工业和生物制造领域的理想一碳（C1）资源，因为它可以通过光催化或电催化从CO₂和氢气（通过水电解）中生产出来。这一策略被认为是实现碳中和最有前景的途径之一，而廉价的来源和灵活的生产工艺降低了甲醇的成本，提升了甲醇生物制造的竞争力。然而，甲醇复杂的代谢过程及其中间产物甲醛的致命毒性为推动代谢流向目标化学品带来了挑战。原生甲基营养菌是甲醇基生物制造的理想宿主，因为它们具有甲醇代谢的天然能力。在这些微生物中，甲基营养酵母因其甲醇同化的天然高效性和现成的甲醇诱导系统而在甲醇生物转化中展现了巨大潜力。特别是，毕赤酵母是一种重要的工业酵母，已被公认为GRAS（普遍认为安全）的微生物。尽管已有研究利用毕赤酵母从甲醇合成了一些化学品，但其效率仍需大幅提高。先前的研究阐明了毕赤酵母甲醇代谢的基本特征，但仍需要更多努力来精确调控甲醇代谢以促进化学品的生产。

作者首先尝试构建一个用于过量生产游离脂肪酸（FFA）的毕赤酵母平台菌株。在酵母中，脂肪酸通过胞质型I类脂肪酸合酶（Fas）进行从头合成，利用乙酰辅酶A（acetyl-CoA）作为前体，丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）作为延伸单位，合成脂酰辅酶A（fatty acyl-CoA）。少量的FFA可以通过非特异性硫酯酶（Tes）从脂酰辅酶A中合成，但过量的FFA可以迅速在脂酰辅酶A合成酶（fatty acyl-CoA synthetases）的催化下转化回脂酰辅酶A。与此一致的是，野生型菌株GS115在使用葡萄糖或甲醇作为碳源时仅积累了约50 mg/L的脂肪酸。通过对毕赤酵母基因组的搜索，鉴定出了两个脂酰辅酶A合成酶基因，分别为FAA1和FAA2。删除FAA1（菌株PC101）显著提高了FFA的积累，而进一步删除FAA2（菌株PC103）略微提高了FFA的产量，表明FAA1在FFA的活化中起主导作用。为了减少脂酰辅酶A的β-氧化，敲除脂酰辅酶A氧化酶基因POX1并未增加FFA的产量。因此，在后续实验中保留了POX1，因为它可能在过氧化物酶体功能中起着重要作用。工程菌株PC103在20 g/L的葡萄糖和20 g/L的甲醇条件下分别生产了860和415 mg/L的FFA，对应的细胞密度（OD600）分别为15.2和8.9。这一结果表明，甲醇代谢在FFA合成中更加僵硬，需要谨慎重编程。培养于甲醇条件下的细胞中C18:2脂肪酸的比例略高于培养于葡萄糖条件下的细胞，尽管不饱和脂肪酸的含量均超过65%。

从甲醇产生的游离脂肪酸（FFAs）低于从葡萄糖产生的游离脂肪酸，表明需要增强代谢通量。因此，作者采用了一种自下而上的合理策略，以改善在毕赤酵母中从甲醇合成脂肪酸。在PC111B中敲除FAA1和FAA2，这是一种基因组整合了CAS9基因的同源重组增强菌株PC110，其游离脂肪酸生产与菌株PC103相似。作者首先尝试增强乙酰辅酶A的供应。过表达来自小鼠的柠檬酸裂解酶基因MmACL，该酶催化柠檬酸分解生成乙酰辅酶A和草酰乙酸，与PC113B相比，改善了游离脂肪酸（FFA）产量23%（在PC121中为596 mg/L）。假设磷酸酮酶-磷酸乙酰转移酶（PK-PTA）途径通过乙酰磷酸（AcP）将碳通量从糖酵解和戊糖磷酸途径转移，从而有助于增强乙酰辅酶A的供应。通过表达来自Bifidobacterium breve的BbPK和来自Clostridium kluyveri的CkPTA构建了异源PK-PTA途径，显著提高了FFA的产量，达到709 mg/L（在PC123中）。细胞内的丙二酸辅酶A含量通常非常低。在这里，采用了启动子替换方法进行丙二酸辅酶A的工程改造。不幸的是，无论是通过PGAP还是PTEF1均未获得转化体，这被推测为是由于丙二酸辅酶A的细胞毒性造成的。由于游离脂肪酸（FFA）生物合成需要大量的NADPH，作者还尝试了几种策略来增加NADPH的供应。依赖NADP⁺的异柠檬酸脱氢酶（Idp2）负责将异柠檬酸转化为α-酮戊二酸并在细胞质中产生NADPH。在菌株PC122中过表达来自S. cerevisiae的ScIDP2，略微提高了FFA的产量。作者还在细胞质中构建了一个人工苹果酸循环以改善NADPH的供应，但无论使用强启动子还是中等强度的启动子，其FFA产量均降低。共同因子的定量分析显示，当在葡萄糖培养基中培养时，毕赤酵母野生型菌株PC111B的NADPH/NADP⁺水平（在18小时为0.62，42小时为0.29）明显高于酿酒酵母（在18小时为0.39，42小时为0.04）。更重要的是，甲醇培养的毕赤酵母PC111B的NADPH/NADP⁺水平（在24小时为1.00，48小时为1.07）显著高于酿酒酵母。尽管在菌株PC113B和PC124中FFA生物合成消耗了大量的NADPH，但它们的NADPH/NADP+水平仍然高于酿酒酵母。这些结果表明，甲醇培养的毕赤酵母细胞对FFA生物合成有足够的NADPH供应，这可能解释了为什么在酿酒酵母中的NADPH工程策略成功而在毕赤酵母中失败。

作者随后过表达了来自S. cerevisiae的线粒体酸转运蛋白Yhm2，以驱动细胞质中ATP:柠檬酸裂解和异柠檬酸脱氢反应的代谢通量，但这却显著降低了FFA产量和生物量。这一观察表明，在使用甲醇作为碳源时，毕赤酵母的三羧酸（TCA）循环代谢通量不及酿酒酵母基于葡萄糖的TCA循环。由于木酮糖-5-磷酸（Xu5P）是甲醇同化的关键前体，作者通过表达果糖-1,6-二磷酸酶基因（FBP1）、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶基因（RPE1）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（ZWF1）和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（GND2）构建了一个补偿途径以供给Xu5P并生成NADPH。然而，这些工程尝试导致FFA产量减少。甲醛是甲醇利用的第一个中间体，并且是导致细胞鲁棒性受损的主要毒性成分。作者发现，游离脂肪酸（FFA）过量产生的菌株PC113B表现出较低的细胞密度和甲醇利用率，且甲醛积累水平更高与对照菌株PC111B相比。这一观察表明，FFA生物合成导致细胞压力，并推动甲醇氧化至高水平的甲醛积累。有趣的是，通过工程化中央代谢以改善乙酰辅酶A和NADPH的供应导致甲醛积累降低，这表明甲醇利用的代谢通量更顺畅地朝向FFA生产。为了进一步推动甲醛同化，作者表达了内源二羟基丙酮合成酶基因DAS2的额外拷贝（菌株PC124），这进一步降低了甲醛积累，并提高了生物量和甲醇利用率。特别是，菌株PC124中甲醛的积累明显低于非FFA产生菌株PC111B。此外，DAS2过表达与中央代谢重构（菌株PC124）相比于母株PC113B显著减少了活性氧（ROS）压力），并改善了FFA生产，这表明增强甲醛同化对去毒化和提高细胞鲁棒性是有益的。这些结果显示，中央代谢的整体重构对推动代谢通量朝向产品生物合成，同时减轻甲醇氧化引起的毒性是至关重要的。

为了测试工程化菌株在甲醇中生产游离脂肪酸（FFA）的潜力，作者使用原养型菌株PC124H（在PC124中原位恢复HIS4基因）在摇瓶和生物反应器中进行了补料分批发酵。在摇瓶补料发酵中，工程化菌株生产了5.1 g/L的FFA，其中2.8 g/L存在于水相中。在生物反应器中，FFA的滴定浓度达到了23.4 g/L（其中水相中为9.6 g/L），甲醇消耗速率为1.4 g/L/h。FFA的产率为0.078 g/g甲醇，占理论产率的24.4%，这与目前酿酒酵母中从葡萄糖获得的最大FFA产率相当，表明工程化菌株在工业应用中具有巨大的潜力。有趣的是，来自生物反应器培养细胞的不饱和脂肪酸（C18:1、C18:2和C16:1）的比例（54%）远高于摇瓶培养细胞的比例，这可能归因于生物反应器中更充足的氧气供应，因为氧在脱饱和过程中作为电子受体。

通过在FFA过量生产的背景下，表达来自Mycobacterium marinum的密码子优化的羧酸还原酶基因MmCAR、来自青霉属Aspergillus nidulans的辅因子4’-磷酸泛酰基转移酶基因NpgA和来自酿酒酵母的醇脱氢酶基因ScADH5，从甲醇和葡萄糖中分别产生了35.2和90.8 mg/L的脂肪醇。表达脂肪酰-CoA还原酶基因FaCoAR则产生了远高于FFA还原途径的脂肪醇产量，这与之前的观察一致。FFA还原途径中脂肪醇产量低可能归因于FFA的分泌，这使得基质FFA的获取和利用变得困难。接下来，作者尝试通过脂肪酰-CoA还原途径增强脂肪酰-CoA的供应，以改善脂肪醇的生物合成。使用代谢工程策略来增强乙酰-CoA、NADPH和甲醇同化的供应是一个容易想到的思路，但在进行多轮基因操作时，这非常耗时。因此，作者通过将FAA1和FAA2恢复，并将FaCoAR的基因组整合到其原始基因组位点，转化FFA过量生产的菌株以生产脂肪醇。与此一致，在FFA过量生产菌株PC124中整合一个FaCoAR拷贝并恢复FAA1，产生了菌株PC172，使其脂肪醇产量达到142 mg/L，是无工程中心代谢的野生型来源菌株PC170的2.5倍。重新引入FAA1减少了FFA的积累，再次表明FAA1在毕赤酵母中激活FFA的主要作用。作者推测，在乙酰-CoA和NADPH水平增强的背景下，FaCoAR的表达可能是一个瓶颈，而之前的研究显示，缺失醛脱氢酶基因HFD1有利于通过阻止脂肪醛的消耗来提高脂肪醇的产量。因此，作者通过在HFD1位点整合另一拷贝的FaCoAR基因（菌株PC174）来敲除HFD1，这提高了脂肪醇的产量41%（201 mg/L），而单独缺失HFD1（菌株PC173）仅提高了10%。进一步在基因组位点FAA2整合另一拷贝的FaCoAR基因（菌株PC176）导致脂肪醇产量和细胞生长显著下降。这一结果表明，两个FaCoAR拷贝对转化细胞脂肪酰-CoA向脂肪醇生产是最佳的，而过量表达FaCoAR则会通过耗尽细胞脂肪酰-CoA造成代谢负担。对于补料批发酵，构建了一个原营养菌株PC174H，通过原位恢复PC174中的缺陷标记基因HIS4，使其在摇瓶培养中产生了233 mg/L的脂肪醇。在生物反应器中对PC174H进行补料培养，脂肪醇的高水平产量达到2.0 g/L，甲醇消耗率为1.2 g/L/h，细胞密度（OD600）为163。脂肪醇的主要成分为十六醇（C16:0，36%）、十八醛（C18:0，26%）和9-十八烯醛（C18:1，36%）。值得一提的是，53%的脂肪醇被分泌，而之前的研究表明，使用葡萄糖作为碳源时，脂肪醇主要在细胞内积累。