病毒尚未硝烟尽，军团曲霉再相生 — 1例重症病毒性肺炎合并军团菌和曲霉菌感染的早期诊断和治疗

前 言

侵袭性肺部真菌感染（invasive pulmonary fungal infections, IPFI）是指真菌引起的支气管肺部真菌感染，即真菌对气管支气管和肺部的侵犯，引起气道粘膜炎症和肺部炎症肉芽肿，严重者引起坏死性肺炎，甚至血行播散到其他部位。

曲霉菌是一类普遍存在的真菌，根据病人免疫状态及潜在肺部疾病的不同，可以造成肺部多种形式的损害及影像学表现。流感作为侵袭性肺曲霉菌病的独立危险因素，流感合并肺曲霉病是当今临床面临的重要挑战。

军团菌常存在于水和土壤中，可经供水系统、空调和雾化吸入而被吸入引起呼吸道感染，由于其不易培养和鉴别，常易被临床忽视。

本案例中介绍了1例重症病毒性肺炎患者，利用多重病原体核酸检测联合毛细管电泳技术结合微生物回报烟曲霉生长，提示患者甲型流感病毒合并肺部嗜肺军团菌和烟曲霉感染。

核酸检测作为培养的辅助手段，可以直接检测病原体，能够早期、快速、特异性的鉴别，指导临床合理用药，特别是为重症患者及时快速的诊断提供依据，以提高患者的生存率。

案例经过

患者，男，75岁，因“反复咳嗽咳痰5年，加重伴呼吸困难半月”于2023.12.21入院，入院前半月自觉“感冒”后突发胸闷气短，呼吸困难，活动后加重，休息可缓解，咳黄白色黏痰，伴有咽痛，四肢乏力，无发热、头晕、呕吐。于外院行抗感染治疗后（具体药物不详），效果不佳，遂来我院进一步治疗。入院时患者一般状态较差，言语欠清晰。

入院查体：T 36.8℃；P 123次/分；R33次/分；BP 130/70 mmHg。桶状胸，肺部叩诊过清音，双肺呼吸音粗，布满哮鸣音及干啰音，双下肺可闻及痰响。心率不齐，心音尚可，各瓣膜未闻及病理性杂音。双下肢无水肿。

既往史：吸烟20年。5年前于外院诊断“COPD”，房颤病史20余年，平素口服华法林抗凝治疗；

入院时诊断：COPD急性加重；二型呼吸衰竭；肺性脑病；肺部感染；持续性心房颤动；电解质代谢紊乱；低钾血症；

实验室检查：C反应蛋白13.46 mg/L，白细胞12.64×10⁹/L，中性粒细胞比例（NEUT）73.6%，PCT 0.23 ng/mL，D-D二聚体0.1 mg/L FEU；血气分析（氧气吸入2L/min）：PH 7.437，氧分压PO₂75 mmHg，动脉血二氧化碳分压PCO₂51.2 mmHg，细胞外液剩余碱（BE）13.1mmol/L；

呼吸道病原体核酸检测：甲型流感病毒核酸检测 阳性（+）；新型冠状病毒核酸检测 阴性（-）；血1-3-b-D葡聚糖（G实验）、曲霉菌半乳甘露聚糖检测（GM实验）、曲霉菌抗体（IgG）检测均阴性（-）。

影像学肺CT可见：1.支气管炎、肺气肿。2.双肺散在炎症改变。（如图1A）

图1A  肺部CT影像

诊疗经过：

2023年12月21日：①尼可刹米呼吸兴奋中枢；②哌拉西林他唑巴坦4.5g q12抗感染治疗；③甲泼尼龙80mg抗炎治疗；④奥司他韦抗病毒治疗；⑤辅以止咳化痰平喘对症治疗。

2023年12月25日：复查C反应蛋白26.75mg/L，白细胞18.92×10⁹/L，中性粒细胞比例（NEUT）77.6%。患者血象出现上升，双肺听诊仍弥漫干湿啰音，应用抗生素周期较长且效果不佳，不除外感染致病菌变迁，不除外真菌感染。

更改治疗方案为哌拉西林他唑巴坦4.5g q8加强抗感染，联合伏立康唑0.2g q12抗真菌治疗。留取痰液送检，待细菌、真菌、非典型病原体24项核酸检测回报指导抗感染方案。

2023年12月26日：痰液细菌、真菌、非典型病原体24项核酸检测回报提示：鲍曼不动杆菌 阳性（+）；白色念珠菌 阳性（+）；烟曲霉 阳性（+）。与临床联系，医生根据患者临床症状和影像学，高度怀疑曲霉菌感染可能，故立即调整用药方案为美罗培南、伏立康唑抗感染治疗。

2023年12月28日：痰真菌培养回报：白色假丝酵母菌。复查肺HRCT示（图1B）：1.支气管炎，肺气肿；2.双肺支气管扩张合并感染，较2023.12.21略进展，与家属沟通后于2023年12月29日行纤维支气管镜检查，留取肺泡灌洗液送检。

图1B  肺部CT影像

2023年1月2日：BALF细菌、真菌、非典型病原体24项核酸检测回报（图2）：嗜肺军团菌 阳性（+）；烟曲霉（+）；灌洗液曲霉菌半乳甘露聚糖检测（GM实验）6.689。

再次和临床联系，提示患者伴有嗜肺军团菌感染可能，医生根据患者临床表现，调整用药方案为美罗培南、伏立康唑、左氧氟沙星抗感染并联合复方新诺明预防机会性感染。

图2  多重PCR联合毛细管电泳峰图。A：嗜肺军团菌电泳峰（275-298bp）；B：烟曲霉电泳峰(198-213bp)

2023年1月5日分泌物培养回报示（图3）：烟曲霉生长；经上述治疗后，患者咳嗽憋喘较前明显缓解，活动后气促明显改善，听诊双肺干啰音较入院时明显减轻并出院。

图3  烟曲霉SDA平板生长和乳酸棉酚兰染色

案例分析

一、临床案例分析

本病例患者为老年男性，有反复咳嗽、咳痰、活动后气促病史，近期出现胸闷气短，呼吸困难，结合入院检查CRP、白细胞较高，肺CT可见明显感染，故初步诊断为COPD急性加重；二型呼吸衰竭；肺性脑病；肺部感染。

入院后予以无创通气，及时给予患者经验性抗炎抗感染治疗（甲泼尼龙、哌拉西林他唑巴坦）。呼吸道病原体核酸检测提示甲型流感病毒（+），故给与抗病毒治疗（奥司他韦），但患者病情持续加重，肺部CT出现进展，予支气管纤维镜检查，调整抗感染方案（伏立康唑），对症支持治疗。

及时送检肺泡灌洗液行细菌、真菌、非典型病原体24项核酸检测同时送分泌物细菌培养完善相关病原学检查。后相关PCR检查在患者肺泡灌洗液中检测出嗜肺军团菌阳性（+），烟曲霉（+），GM实验阳性，分泌物培养烟曲霉生长（图3）。

根据《桑福德抗微生物治疗指南》增加针对嗜肺军团菌的喹诺酮类药物，故及时调整了抗感染方案（美罗培南+伏立康唑+左氧氟沙星+复方磺胺甲恶唑），后患者血象分析结果逐渐好转，双肺干啰音得到明显改善，最终好转后出院。

二、检验案例分析

（一）嗜肺军团菌为何难以诊断？

嗜肺军团菌的快速诊断方法有尿抗原检测和PCR。尿抗原检测是嗜肺军团菌诊断中的革命性方法，具有70-90%的敏感性和95-100%的特异性，可在15min内得到结果，但缺点是只能针对血清1型。

PCR是诊断嗜肺军团菌最敏感的方法，特异性为95-100%，可用于肺军团菌的早期诊断，可检测嗜肺军团菌的各亚型。嗜肺军团菌诊断的金标准是培养。其分离培养需要营养丰富的特殊培养基，同时培养的敏感性变动幅度较大（10-80%）、周期长（3-14d）。

嗜肺军团菌诊断的另一标准是急性期和恢复期双份血清嗜肺军团菌特异性抗体检测法（IFA法或ELISA法），滴度呈4倍或4倍以上变化，然而这一方法的确诊价值仅针对于血清1型，且双份血清要间隔3-10周，实验的敏感性变化范围较大(40% ~ 80%)，并不适合于疾病的临床诊断。

因此，军团菌肺炎的快速诊断不能依赖痰培养和血清抗体检测^[1]，故对嗜肺军团菌的核酸检测就显得尤为重要。

（二）多重PCR联合毛细管电泳检测技术优势

多重PCR是在一个反应体系中进行两种及以上PCR片段特异性扩增的技术，其反应原理、操作过程及仪器均与常规PCR相同，可以对不同的模板实现一次性同时扩增，从而提升检测靶标通量。

联合毛细管电泳对多重PCR产物进行电泳，由于DNA片段整体带负电荷，在电场作用下会在电泳仪内向正极迁移，迁移速率受PCR扩增片段大小的影响。

故在选择适合的Size Marker基础上，可将大小不同的PCR产物在电泳过程中分开，通过检测反应产物片段大小（bp）从而鉴定出不同的检测靶标，即可以准确区别细菌、真菌和非典型病原菌感染，避免抗生素滥用引起的多重耐药菌感染（图4）。

图4  多重PCR联合毛细管电泳Size Marker峰图（50-800bp）

此技术与传统培养相比较，痰液的培养阳性率为26.68%，痰液的多重PCR阳性率可达到52.31%；肺泡灌洗液的培养阳性率为11.05%，肺泡灌洗液的多重PCR阳性率可高达56.00%。多重PCR检测技术具有更快速，阳性率高，高通量，卫生经济学获益更多的特点。

知识拓展

一、流感病毒合并真菌感染的诊疗

在病毒感染大流行的时代，一个高致病性禽流感毒株抗原与人株抗原发生转移，即可导致新的高致病性菌株的出现。而针对流感病毒的专家共识指出，快速鉴定流感病毒亚型对及时救治感染病例以及制定有效的流感疫情防控措施有着至关重要的作用。

目前出现最多的是甲型流感病毒和乙型流感病毒。特别是免疫力低下或抑制、合并基础疾病的危重症患者，受各种环境和护理因素导致呼吸道感染反复发生，症状复杂多样，多以病毒为主，有时还会伴有混合感染，故给临床诊断带来极大挑战。

有文献报道^[2]，对病原体估计不足，可导致40%初始经验性治疗失败，进而导致并发症风险增加、病死率增高、治疗费用显著升高。由于治疗不同病原体所用的首选药物不同，故无论是病毒感染还是细菌感染，均建议进行病原学检查，以达到指导目标用药的目的。

采用支气管肺泡灌洗液标本进行细菌、真菌、非典型病原体多重核酸检测，同时联合分泌物培养、真菌血清学检测（G实验、GM实验等），可及时发现病原菌，并尽早识别混合感染的发生，为呼吸道感染的早期诊断及精准用药治疗提供依据。

二、嗜肺军团菌的特性和治疗

嗜肺军团菌广泛存在于水源、空气、藻类生物中，属革兰阴性杆菌，无荚膜，是单核细胞和巨噬细胞兼性细胞内寄生菌。主要累及肺，亦可导致多系统性损害，临床症状为肺炎伴全身毒血症状。嗜肺军团菌有16个血清型，欧美国家嗜肺军团菌的血清型80-90%为1型，我国北方地区多以Lp12多见。

由于是寄殖于细胞内的细菌，药物应选择易渗透入吞噬细胞内的大环内酯类、氟喹诺酮类药物。研究表明，对于轻、中、重症嗜肺军团菌病，左氧氟沙星的有效率达90%以上。

对于单一抗生素治疗无效的重症患者可以考虑联合用药。虽然经过治疗后症状有所改善，但影像学在短时间内（1周内）仍有进展，或肺部浸润几周甚至几个月才能完全吸收也是军团菌肺炎的影像学特点^[3]。

案例总结

一、临床案例总结

病毒感染易导致气道上皮连接中断、纤毛清除受损和细胞功能丧失，从而促进细菌或真菌结合到细胞表面引起混合感染。军团病痰涂片的革兰染色会显示有大量白细胞，细菌往往是来自上呼吸道的正常菌群，嗜肺军团菌菌体少见，因此不能根据痰涂片的结果排除嗜肺军团菌的诊断。

重症肺炎应该警惕嗜肺军团菌合并感染引起的情况，根据患者的临床症状和体征进行评估，进行快速病原学检测，尽早启动有效治疗，是成功诊治病毒性肺炎合并军团菌和曲霉菌感染的关键。

二、检验案例总结

侵袭性肺曲霉病合并社区获得性嗜肺军团菌感染的发病率在国内外均呈逐年上升趋势，具有不典型性和易发多脏器功能损害的特点，临床上由于嗜肺军团菌培养困难，抗体检测特意度和灵敏度难以达到诊断要求，故临床上极易漏诊，故建立嗜肺军团菌快速诊断技术以及及时送检BALF等高质量呼吸道标本对于嗜肺军团菌的诊断极为重要。

分子检测在病原体检测中优势明显，灵敏度高，特异性强，快速准确。近年来发展比较快，已成为病原体诊治中不可或缺的重要工具，而且已广泛应用于感染性疾病的个体化诊断和治疗中。

专家点评

点评专家：肖晓光 大连医科大学附属第一医院检验科

在本次案例的诊疗过程中，患者有慢性阻塞性肺病病史，甲型流感病毒引起重症肺炎，临床症状复杂，表现多不典型，经验性抗感染治疗未见明显改善。经临床与检验者及时沟通，采用支气管肺泡灌洗液行细菌、真菌、非典型病原体多重核酸检测联合分泌物培养和GM实验，及时发现病毒性肺炎合并军团菌和曲霉菌感染，精准用药进而获得满意的治疗效果。

多重病原菌的核酸检测与培养法联合应用，可明显缩短经验治疗到循证治疗之间的时间，为呼吸道感染症候群的早期诊断和抗感染药物的合理使用提供依据。最后，临床与检验工作者的密切沟通与合作，将为揭开生命的迷雾打下坚实的基础。

参考文献

[1]吴丽媛,赵建玉,周倩倩,鲁辛辛.3例重症嗜肺军团菌社区获得性肺炎患者的病原学诊断分析[J].临床检验杂志,2019,37(7):553-556,558.

[2]Menéndez R, Torres A, Reyes S, Zalacain R, Capelastegui A, Aspa J, Borderías L, Martín-Villasclaras JJ, Bello S, Alfageme I, de Castro FR, Rello J, Molinos L, Ruiz-Manzano J. Initial management of pneumonia and sepsis: factors associated with improved outcome. Eur Respir J. 2012 Jan;39(1):156-62

[3]薛洪源,葛向华,蔡长春,闫成.社区获得性嗜肺军团菌肺炎治疗的抗菌药物使用分析[J].中国感染与化疗杂志,2012,12(5):348-351.

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