【华西耳鼻喉学术前沿速递】利用体内工程化巨噬细胞重塑肿瘤微环境以根除肝转移瘤-第43期

我们首先生成了含有来自小鼠甘露糖受体C型1（Mrc1）基因的假定的1.8kb启动子序列的LV（见图S1A）。MRC1在大多数巨噬细胞亚群中表达，包括KCs，并在替代性激活的巨噬细胞（如TAMs）中上调。然后，我们将Mrc1启动子序列下游的GFP编码序列（产生Mrc1.GFP LV）克隆下来，并制备了Mrc1.GFP LV库存（见图1A）。Mrc1.GFP LV在接触IL-4（M2样）的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中显著驱动了转基因表达，但在接触LPS/IFNγ（M1样）的BMDMs中未观察到表达（见图S1B-S1E）。我们向免疫缺陷小鼠静脉注射（i.v.）Mrc1.GFP LV后，仅在肝脏细胞（KCs和肝窦内皮细胞，LSECs）和部分脾脏细胞（Mrc1阳性巨噬细胞）中观察到GFP表达。我们未在血液细胞、骨髓、肺、腹股沟淋巴结、小肠和脑等其他器官中观察到GFP表达或整合的LV拷贝（见图1B-1D）。为了进一步精确地将基因表达定位于巨噬细胞，我们利用了内源性微小RNA（miRNA）调控，这已被证明通过在转录本的3' UTR区域引入互补的miRNA靶标序列（miRTs），可以减少非靶向细胞中转基因的表达。在双向载体设计中，4个串联拷贝的miRT-122-5p即可完全阻止肝细胞中的GFP表达，同时保留了其在KCs中的表达，而4个拷贝的miRT-126-3p则阻止了LSECs中的GFP表达，但未阻止KCs中的表达（图S1F-S1K）。基于这些结果，我们在Mrc1.GFP LV中的GFP下游分别引入了4个拷贝的miRT-122-5p和miRT-126-3p，生成了Mrc1.GFP.miRT LV（图1A）。然后，我们通过门静脉注射将表达mCherry的MC38 CRC细胞或来自AKTPF小鼠的CRC细胞（APCδ716; KrasG12D; Tgfbr2-/-; Trp53R270H; Fbxw7-/-）植入肝脏，以更好地模拟肝脏中的多发性转移性种植。我们向肝脏转移小鼠模型静脉注射了Mrc1.GFP或Mrc1.GFP.miRT LV。与在无肿瘤小鼠中观察到的结果一致，Mrc1.GFP在肝巨噬细胞、LSECs和脾脏MRC1-阳性巨噬细胞中诱导了GFP表达，而在miRNA调控下（Mrc1.GFP.miRT LV），GFP在LSECs中的表达几乎完全消失（图1E）。在MC38和AKTPF衍生的转移性病灶中，我们发现在肝脏周围转移区域存在GFP+细胞的富集，尤其是在F4/80+VSIG4+和F4/80+CLEC4F+ KCs中，这表明这一区域中KCs的Mrc1基因的优先转录和/或其启动子的活性上调。值得注意的是，F4/80+ CLEC4F-或F4/80+ VSIG4-巨噬细胞中也有少量GFP+细胞，它们主要存在于肿瘤中，很可能代表了单核细胞来源的TAMs（图1F、1G、S1L和S1M）。我们没有在大脑、小肠、肺和腹股沟淋巴结等其他器官中观察到GFP表达（图S1N）。总之，新开发的Mrc1.GFP.miRT LV在肝脏巨噬细胞中的选择性分布和表达，以及其在肿瘤病灶周围富集的表达，支持了在体内通过基因工程改造肝脏巨噬细胞（包括KCs和TAMs）以向肝转移病灶输送治疗分子的可能性。

我们随后利用工程化的巨噬细胞将IFNα输送至肝转移灶。为此，我们将Mrc1.GFP中的GFP替换为编码IFNα的DNA序列以构建IFNα LV。为了高效地转染肝巨噬细胞，我们采用先前描述的生产工艺，旨在获得含较少杂质（如可能导致额外固有免疫激活或不良系统性效应的质粒和内毒素）、高滴度的LV库存。然后，我们通过向免疫功能正常的小鼠静脉注射IFNα LV或含有相同调节元件但不含转基因的Control LV（图2A），在体内对肝巨噬细胞进行工程化改造。既往研究报告称，这些剂量范围能高效靶向肝细胞（图2A）。在接受了IFNα LV工程化肝巨噬细胞的小鼠中，我们观察到快速的转基因表达，表现为血浆中IFNα浓度的增加，在3周时达到700至1000 pg/mL的峰值，并在此后稳定在200至700 pg/mL之间（图2B）。与Control LV组相比，这些IFNα水平保持稳定直至240天，之后病毒载量逐渐下降，直至几乎无法检测的水平（第360天）。与对照组相比，IFNα LV治疗小鼠肝脏中的整合LV拷贝数较低，这表明IFNα LV转导的肝脏细胞中长期存在负选择作用（图2C）。与对照组相比，IFNα LV治疗小鼠随着时间的推移，循环中的B细胞和嗜酸性粒细胞数量减少。与此同时，驻组织的单核细胞、红细胞和血红蛋白水平也出现了轻微的下降（图2D和S2A）。为了探索B细胞数量的下降是否与B细胞激活和自身抗体产生有关，我们测量了盐水（PBS）、对照LV或IFNα LV治疗小鼠在第52天和366天的血浆中是否存在自身抗体，结果显示所有分析的组别之间没有差异（图S2B）。此外，我们没有观察到肝脏或组织损伤的指标（如谷氨酰胺氨基转移酶，ALT和天冬氨酸氨基转移酶，AST）水平的变化，这表明IFNα LV治疗小鼠不会造成肝毒性（图2E）。为了进一步研究是否存在肝巨噬细胞表达的外源性IFNα引起的炎症、组织损伤或其他改变，我们在实验结束时对最相关的器官进行了组织病理学分析，结果显示所有组织中均未发现与治疗相关的异常情况（图2F和S2C）。总之，这些结果表明，肝脏巨噬细胞驱动的IFNα表达导致了长期稳定的血浆IFNα水平，在小鼠中是安全且耐受良好的。

我们向先前接受MC38肝转移造模的小鼠系统性注射了两种不同剂量（1.5*10^9或1.5*10^10 TU/kg）的IFNα LV（图3A）。我们发现血浆中存在具有剂量依赖性的持续IFNα表达，并且肝中存在具有剂量依赖性的LV拷贝整合，IFNα LV处理小鼠血浆中IFNα水平与循环B细胞数量呈负相关（图3B和S3A/B）。我们发现两种IFNα LV剂量均能延迟肿瘤进展，在3只小鼠（1只为较低剂量，2只为较高剂量）中实现了完全缓解（CR）和长期生存（图3C和3D）。对再次接受皮下MC38肿瘤造模的CR小鼠的研究显示，肿瘤生长受到抑制，这表明小鼠机体对肿瘤相关抗原产生了适应性免疫记忆（图S3C）。

为了进一步研究诱导表达IFNα对肿瘤微环境（TME）的影响，我们使用AKTPF结直肠癌细胞生成实验性肝转移瘤。AKTPF肝转移瘤再现了人类结直肠癌肝转移瘤的一些组织病理学特征，如由结直肠癌细胞形成的上皮腺体结构、坏死区域、纤维化、血管生成和免疫浸润（图S3D和S3E）。我们进行了剂量反应实验，IFNα LV的剂量范围为5*10^8 TU/kg至4*10^10 TU/kg，结果显示随着IFNα剂量的增加，血浆和肝脏中的IFNα输出量呈剂量依赖性增加，并且肝脏转移瘤体积显著降低，同时伴有表达炎症表型标志物的TAM比例的增加（图3E-3G和S3F）。与先前的数据一致，我们观察到随着IFNα剂量的增加，循环B细胞的数量呈剂量依赖性下降（图S3G）。在任何测试剂量下对肝脏进行组织病理学分析均未发现肝细胞异常或炎症迹象的增加，并且未观察到接受治疗的小鼠出现肝脏毒性症状。即使是在IFNα LV的最高剂量下，也未观察到明显的毒性，这可以通过测量血浆转氨酶水平（图S3H和S3I）来证实。然后，我们又在有AKTPF肝转移小鼠中进行了两组独立的实验，使用剂量为5*10^9 TU/kg的IFNα LV，因为在比较抗肿瘤效果与系统性IFNα暴露时，该剂量表现出最佳的治疗指数。在两组实验中，IFNα LV延迟了肿瘤进展，并使20只小鼠中的8只达到完全缓解（图3H-3J和S3J-S3L）。根据我们之前在MC38实验性转移模型中的发现，我们观察到TAMs向炎症表型偏移，并发现肿瘤浸润的CD8+ T淋巴细胞数量增加（图3K-3M和S3M）。

为了研究肝巨噬细胞工程化后肿瘤特异性T细胞的诱导情况，我们系统性地向先前接受MC38细胞免疫的同种免疫功能正常的小鼠体内注射Control LV或IFNα LV，并在治疗后较早时间点收集肿瘤以捕捉肿瘤特异性T细胞的出现。与之前的研究结果一致，肝巨噬细胞的IFNα表达在早期没有显著地使肝转移的生长延迟（图S3N和S3O）。我们通过OVA免疫原性肽（SIINFEKL）与五聚体MHC-I复合物染色识别肿瘤特异性T细胞，结果显示在接受IFNα LV治疗的小鼠中，肿瘤特异性T细胞的数量比接受Control LV治疗的小鼠多（图S3P）。与此同时，炎症表型TAMs的比例呈增加趋势，这与其他实验中在LV递送后的较晚时间点进行终点分析时观察到的结果一致（图S3Q）。我们还观察到，在小鼠中，IFNα的抗肿瘤效果发生了逆转。研究发现，在CD8+ T细胞被耗竭的情况下，AKTPF肿瘤中会出现肝脏转移（见图3N、3O和S3R）。为了探究是否是工程化巨噬细胞释放的IFNα直接激活了CD8+ T细胞，促进了其细胞毒性活性，我们使用了Cd4Cre;Ifnar1flox/flox转基因小鼠，其中Cre重组酶由CD4启动子表达，在共同的CD4+CD8+前体细胞中激活，导致CD4+和CD8+谱系中IFNAR1受体几乎完全敲除（见图S3S）。在这些小鼠中，IFNα LV的治疗效果得以维持，同时CD8+ T细胞的CD44和TBET表达增强，这表明IFNα间接激活了肝脏转移灶中的T细胞（见图S3T-S3V）。与先前的研究结果一致，TAMs上调了抗原呈递的标志物（见图S3W）。这表明，尽管CD8+ T细胞对于IFNα LV介导的肿瘤抑制至关重要，但这些细胞可能并非直接由IFNα激活，而是至少在某种程度上受益于IFNα依赖的肿瘤微环境中的抗原呈递增加。为了研究是否除了CD8+ T细胞之外的其他效应机制也参与了抗肿瘤过程，我们在免疫缺陷的NSG小鼠上进行了探索。结果显示，在NSG小鼠中肝转移生长速度比免疫功能正常的小鼠快，尽管没有达到完全缓解（图S3X和S3Y），但IFNα LV显著减缓了其生长速度。此外，在IFNα LV处理的模型中观察到TAMs中表达炎症表型的比例增加（图S3Z）。总的来说，这些发现与已建立的IFNα的多效性功能相一致，它已被证明可以激活巨噬细胞、抑制癌细胞增殖、增加免疫细胞附着并通过内皮细胞抑制新生血管生成。然而，NSG小鼠中没有达到完全缓解的肿瘤表现出CD8 T细胞耗竭的现象，提示可能需要激活CD8 T细胞介导的免疫以实现IFNα LV的完全治疗活性。

为了评估IFNα治疗对肝转移的保护作用，我们在AKTPF大鼠造模前7天给予IFNα LV预防性注射，观察到所有大鼠都没有出现肝转移（图S3AA和S3AB）。

我们随后研究了工程化巨噬细胞来源的IFNα对肝内注射KrasG12D;Trp53R172H PDAC细胞（K8484）肝转移的影响。我们发现与对照组相比，IFNα LV组中有10只小鼠中有5只出现了CR，肿瘤生长受到了明显抑制（图3P、S3A和S3C）。与具有CRC转移的小鼠相关结果一致，我们发现TAMs和CD8+ T细胞表达活化标记物的比例增加（图S3AD和S3AE）。

总之，这些结果表明，通过系统性注射IFNα LV来进行肝脏巨噬细胞工程化改造，至少在一定程度上可以有效地抑制不同肿瘤类型的肝转移，其主要机制是促进炎症性TAM表型和CD8+ T细胞反应的激活。

为了探究观察到的抗肿瘤反应的机制，我们对接受对照LV或IFNα LV治疗的小鼠的AKTPF肝转移瘤进行了全面的转录组分析。我们观察到，在接受IFNα LV治疗的小鼠的转移灶中，存在IFNα活性诱导的基因表达增加（图S4A）。然后，我们采用空间转录组学方法，在转移性肝脏内调查是否有IFNα信号偏好区域。为此，我们将小鼠分为三个不同的组别：(1)对照组：接受对照LV治疗的小鼠；(2)响应者：与对照组相比，转移灶体积减少的接受IFNα LV治疗的小鼠；(3)抵抗者：与对照组相比，转移灶体积相似的接受IFNα LV治疗的小鼠（图S4B）。值得注意的是，由于分析时缺乏肿瘤组织，我们无法分析CR。然后，我们进行了无监督的聚类分析，将空间点根据相似的转录组特征进行分组（图S4C和S4D）。然后，我们根据空间点与转移灶/肝实质边界的相对距离，将空间点分为不同的空间区域，包括转移灶内部 (空间分区A-C)，转移灶前沿（空间分区D)，转移灶周围（空间分区E、G)，以及完整的肝脏区域（空间分区H)（图4A和S4E)。

同预期一致，我们发现在所有队列中，与癌症相关的生物过程或通路（例如血管生成、p53通路、上皮细胞向间质转化）的基因相比于肝脏转移灶外的区域（转移灶周围和完整肝脏），在肝脏转移灶（内部和前沿区域）中更加富集。与这一观察结果一致的是，上皮细胞相关基因如Epcam、cadherin 1 (Cdh1) 和villin 1 (Vil1) 在内部和前沿转移灶中表达水平较高。相反地，肝细胞相关基因（例如白蛋白，Alb；Apoa2 和 Cyp27a1）以及肝脏相关通路的基因集（例如脂肪生成或胆汁酸代谢）在完整肝区域的表达上调。此外，在系统性Mrc1.GFP.miRT LV递送后，与靠近肝脏转移灶周围的工程化KCs增强的转基因表达能力所一致的是，我们发现I型干扰素响应相关基因（例如Socs1, Stat1和Nlrc5）在IFNα LV队列（响应者和抵抗者）中的肝转移灶和转移灶周围中富集，并证实了LV平台优先工程化接近于肝脏转移灶的KCs。此外，与I型干扰素活性相关并且富集于对γ干扰素反应、对病毒反应、促进细胞因子产生以及T细胞激活等通路的基因的上调也与I型干扰素信号相关。另外，相比抵抗者或对照组，在响应者中，适应性免疫激活通路相关的基因（例如适应性免疫反应以及免疫调节）在内部、前沿和转移灶周围区域上调，并且符合IFNα信号增强的位置。同时，相比对照组，在响应者和抵抗者中与抗原呈递有关的基因 （例如Cd86，H2-Oa和Tap1)都高度表达。值得注意的是，在抵抗者而非对照或响应者中，我们发现位于前沿和转移灶周围区域的IL-10信号通路增加，说明IL-10至少一定程度上可能与抵抗者小鼠中IFNα介导的免疫反应有相互作用。值得注意的是，在抵抗者小鼠的内部、前沿和转移灶周围区域中，与T细胞耗竭和耐受表型相关的标志物，如Tgfb1、Eomes和Gzmk也上调（图4B和4C；表S1）。总之，肝脏巨噬细胞产生的IFNα与响应者小鼠的肝脏转移灶和转移灶周围区域的选择性免疫激活有关。然而，在抵抗者小鼠中，免疫激活程度低于响应者，并且与转移灶/肝脏实质边界区域的IL-10信号富集有关。

我们对同一转移病灶的活细胞进行了单细胞转录组学分析（图S4B）。我们使用了一种无监督聚类方法来识别不同的细胞类型，包括（1）APCs（2）T和NK细胞（3）B细胞（4）中性粒细胞（5）内皮细胞（6）肝细胞（7）癌细胞（图S5A-S5D；表S2）。然后，我们聚焦于APC簇的细胞上。我们发现，与IFNα、IFNγ或LPS信号相关的基因在所有接受IFNα LV治疗的队列中相对富集。另一方面，与IL-10、PGE2和IL-4信号相关的基因在抵抗者队列中上调，而在响应者队列中下调，这表明这些基因可能在诱导对基因疗法活性的抵抗方面发挥作用。与抗原呈递有关的基因，即MHC蛋白复合物和抗原加工和呈递相关基因，在部分响应者队列中上调，而在抵抗者或对照队列中表达最低（图5A）。然后，我们进行了子聚类分析以更好地理解这些结果。我们定义了APC簇中的细胞簇和差异表达基因。在APCs中，我们发现在三个实验组中存在重叠的细胞簇，除了TAM簇，该簇在IFNα治疗后发生了改变，这表明IFNα递送后发生了基因表达重编程。基于这一观察结果，考虑到IFNα对TAM遗传程序的主要影响，我们将所有存在于IFNα LV治疗后肿瘤中的TAMs称为IFNα-TAMs，而将存在于对照LV组中的TAMs称为TAMs。其他细胞簇均根据其基因表达谱进行了手动注释（图5B和S5E）。通过比较TAM亚群之间的差异表达基因，我们发现，对于所有三个队列而言，在IFNα-TAMs中上调而未在TAMs中上调的基因富集于与IFNα/IFNγ响应相关的生物学过程，如Stat1、Socs1和Nlrc5；TNFα信号；LPS激活；以及抗原加工和呈递，如MHC亚基（H2-D1和H2-Ab1、Cd74）、Cd40和Tap1，这符合IFNα-TAMs在积极调节免疫激活方面的作用。另一方面，与TAM的抗肿瘤活性相关的常见促肿瘤基因，如Mmp8、Tmem176B、Trem2和Fn1，在TAM中表达上调，而在IFNα-TAM中则表达下调（图5C和5D）。值得注意的是，即专职抗原呈递细胞（cDC和Mo DC）在响应者组中富集，而在抵抗者和对照组中较少（图5E）。与这一观察结果相一致的是，相比于抵抗者或对照组小鼠，我们发现在响应者小鼠的APC中，与MHC-II限制性抗原呈递相关的基因，如编码MHC-II亚基（H2-Aa、H2-Ab1、H2-Eb1、H2-DMb1和H2-Oa）、MHC-II转录激活因子（Ciita）、Cd74和Cd40等基因表达上调。值得注意的是，MHC-I限制性基因，如编码MHC-I亚基（H2-T22、H2-T23、H2-D1和B2m）、Tap1、Tap2、Tap结合蛋白（Tapbp）和蛋白酶体S20亚基β8和β9（Psmb8和Psmb9）在所有IFNα LV治疗（抵抗者和响应者）组中表达上调。与IL-10在抵抗肝脏巨噬细胞来源的IFNα表达中可能发挥的作用相一致的是，IL-10相关基因，如Tgfb、Cebpb、Il4r、Socs3和Ccl24，与响应者和对照组相比，在抵抗者组中表达上调（图5F）。在所有APC亚群中，表达Ccr7的DCs、cDCs和KCs以及Mo DCs在所有组别中均表达与MHC-II限制性抗原呈递相关的最高水平的基因。因此，与MHC-II限制性抗原呈递相关的APC基因表达差异可能至少部分是由于响应者组中专职APC，如Mo DCs和cDCs的浸润增强所致。另一方面，与MHC-I限制性抗原呈递相关的基因上调可能由IFNα的直接作用引起（图5G）。总之，来自肝脏巨噬细胞的IFNα促进APC向具有免疫刺激表型的形态重塑，增强了抗原呈递功能。然而，与响应者小鼠相比，抵抗者小鼠的MHC-II限制性功能和DC浸润似乎降低了。同时，来自抵抗者小鼠的APCs的IL-10信号增强，这提示缺乏对IFNα的反应、IL-10上调和MHCII限制性抗原呈递功能受损之间存在关联。

虽然LV依赖的IFNα信号通路在定义TAMs的极化方面起着主导作用，但我们通过使用标准化方法，成功地将两种治疗条件下的TAMs归为重叠但异质的子群。结果揭示，LV依赖的IFNα信号通路对肿瘤活性相关的基因标记的亚群的贡献较低，而对由促炎标记物标记的亚群的贡献较高（图S5F-S5H）。在所有TAM子群中，LV依赖的IFNα信号通路通常会上调与IFNα信号通路和MHC-I呈递相关的基因表达（图S5I）。

通过使用我们单细胞分析得到的基因标志物或已建立的KC标志物，我们对图4中的空间转录组数据进行了分解，发现TAM标志物在肿瘤内（区域A至D）的得分最高，并随着向健康间质（区域E至H）的移动而急剧下降，而KC标志物在肿瘤内得分较低，在周围转移区域（区域E至G）和完整组织（H）的得分较高，这与图1的生物分布分析相符（图5H；表S3）。有趣的是，在IFNα LV治疗的小鼠中，KC标志物在所有肿瘤区域的得分都较高，并在周围转移区域达到最高峰，这表明这些细胞的招募、激活或增殖得到了增强。

我们随后对三个实验组中的T细胞和NK细胞亚群进行了差异表达分析。与TAM类似，所有接受IFNα LV治疗的实验组中都富集了IFNα和IFNγ信号通路相关基因。相反，仅在部分应答组中上调了与免疫激活（即T细胞介导的细胞毒性、自然杀伤细胞激活或细胞杀伤调节）相关的基因（图6A）。然后，我们进行了无监督子集聚类分析，以识别T和NK细胞亚群中的特定细胞群，并手动注释了生成的聚类。我们在所有三个实验组中都发现了重叠的细胞群（图6B和S6A；表S4）。在耐药小鼠中，我们观察到了一群调节性CD4+ T细胞，其转录特征与先前描述的Tr1细胞相似（此处称为Eomes CD4+ T细胞），表达CD4+ T细胞耗竭的标志物，如Ctla4、Gzmk、Lag3和PD-1（Pdcd1），以及与免疫抑制相关的基因，如IL-10受体（Il10ra）、Il10和转录因子Eomes，并且不表达转录因子Foxp3（图6C和S6B）。另一方面，我们在响应者群体中观察到了CD8+ T效应细胞的富集（图6D）。后者具有类似于组织驻留效应记忆T细胞的转录组特征（图6E和S6B），此前曾被报道与对免疫疗法的反应相关联。此外，相比于对照组，肝脏巨噬细胞释放的IFNα使CD8+ T细胞的IFNα和IFNγ信号增强（图S6C）。值得注意的是，与对照组或耐药小鼠相比，响应者小鼠中与T细胞耗竭相关的基因（如Pdcd1、Lag3、TIM-3（Havcr2）、Ctla4、Eomes、Tox、Ccl3、Ccl4和Casp3）下调（图6E）。相反，与适应性免疫反应、T细胞介导的免疫和细胞毒性相关的基因，如Tcf7、Tbx21、Cd69、Itgae、Itga1、Cd7、Il2和Tnf，在响应者小鼠中比耐药小鼠上调更多。总之，这些数据表明，工程化巨噬细胞释放的IFNα通过重塑T细胞浸润，增强了响应者小鼠的适应性免疫，同时抑制了T细胞耗竭。相反，在具有抗药性的小鼠中，浸润的Eomes CD4+ T细胞和增强的CD8+ T细胞耗竭可能会阻止抗肿瘤作用。

我们随后研究了在人类结直肠癌（CRC）肝转移瘤中，是否也存在IFNα信号通路与TME中Eomes CD4+ T细胞的存在呈正相关的情况。为此，我们使用了从本中心收集的人类CRC肝转移瘤的转录组测序数据，发现具有较高IFNα信号通路评分的患者具有较高的Tr1标志物评分（图7A、7B和S7A）。然后，我们使用纳米孔RNA技术分析了患有CRC肝转移瘤患者的周围转移灶和转移灶的肝脏区域。与体外转录组数据和我们的小鼠数据一致，我们观察到IFNα评分与Tr1评分、CTLA4表达和HLA-C表达在周围转移灶和转移灶的肝脏区域之间存在正相关（图7C）。此外，与计算IFNα评分所采用的标志物无关的抗原呈递、免疫细胞激活或其他IFNα刺激的基因与IFNα评分呈正相关（图7D）。

我们随后对该队列中11例肝转移癌样本进行了免疫组织化学染色，其中6例为高IFNα信号评分患者，5例为低IFNα信号评分患者。我们观察到，与IFNα低评分组相比，高IFNα评分组患者的肿瘤组织中浸润的LAG3+ CD4+ T细胞的百分比更高（图7E和S7B）。值得注意的是，LAG3已被报道为T细胞耗竭的标志物，也是人类Tr1细胞的标志物。我们对高IFNα信号评分组中的两名患者进行了个案研究，观察到肿瘤组织中有LAG3+ EOMES+ CD4+ T细胞和CTLA-4+ CD4+ T细胞的存在（图7F）。与这一发现相一致的是，高IFNα组CD4+ T细胞表达CTLA-4的比例高于低IFNα组（图S7C）。总的来说，这些发现表明，与CTLA-4表达一样，Tr1-样细胞也与内源性IFNα信号呈正相关，可能至少在一定程度上抵消了TME中的免疫激活。

在对干扰素α耐药的小鼠中，我们发现IL-10信号增强，MHC-II抗原呈递基因表达降低，Eomes CD4+ T细胞浸润增强，CD8+ T细胞耗竭加剧。这一观察结果与先前的研究相一致，这些研究表明IL-10可能在Eomes CD4+ T细胞的分化、积累和效应功能中发挥作用。Eomes CD4+ T细胞已被描述为通过穿孔素介导的直接杀伤DCs来抑制抗原呈递，并且通过IL-10分泌来抑制CRC肝脏转移灶中的T细胞活性。在这些观察结果的基础上，我们通过使用一种单克隆抗体（a-IL-10R）来抑制IL-10信号。将接受AKTPF肝转移造模并接受IFNα或对照LV治疗的小鼠进行一系列α-IL-10R或同型IgG的给药。α-IL-10R阻断了IFNα诱导的Eomes CD4+ T细胞的积累，表明在肝脏转移灶中，IL-10信号对于这种反应是必要的。然而，IFNα和α-IL-10R的联合治疗的疗效低于IFNα LV，这表明IL-10信号可能对于IFNα发挥治疗活性是必要的（图8A、8B和S8A）。值得注意的是，α-IL-10R和IFNα LV的组合增加了循环T细胞上的PD-1表达，支持IL-10在存在IFNα时调节T细胞表型的作用（图S8B）。

我们观察到，Ctla4在Eomes CD4+ T细胞、耗竭的CD4+和CD8+T细胞以及Foxp3调节性T细胞（Treg细胞）中表达（图S6B）。此外，耐药小鼠的CD8+T细胞中Ctla4的表达显著上调。值得注意的是，CTLA-4在Tr1细胞中可能在抑制T细胞功能以及减弱抗原呈递功能等方面起着关键作用（包括对APCs中结合CD80/CD86的共刺激分子的抑制）。基于这一观察，我们将肝脏巨噬细胞为基础的IFNα递送与抗CTLA-4单克隆抗体给药方案（a-CTLA-4，图8C）结合起来。与单独使用任何一种治疗方法相比，肝脏巨噬细胞产生的IFNα与α-CTLA-4的组合在MC38和AKTPF两种不同的CRC肝脏转移模型中显著抑制了肝脏转移的生长（图8D、8E、S8C和S8D）。令人惊讶的是，在AKTPF肝脏转移的小鼠中，我们观察到高达70%的小鼠在IFNα和CTLA-4组合治疗后显示出完全缓解。这一结果表明，通过抑制调节性Eomes CD4+ T细胞、耗竭的CD4/CD8+ T细胞和Foxp3+ Treg细胞中的CTLA-4，增强APCs的抗原呈递，可以显著抑制肝脏转移的生长。CD4+ Treg细胞显著增强了IFNα LV的治疗活性，揭示了CTLA-4在治疗抵抗中的重要角色。

我们随后重复了实验，并在治疗后的较早时间点发现了转移灶，并对活细胞进行了单细胞转录组学分析和TCR克隆性分析（表S5）。虽然我们重现了IFNα LV诱导APC重编程的早期发现，但与α-CTLA-4的联合使用进一步增强了与MHC-I和MHC-II抗原呈递相关的基因的上调，并进一步降低了与IL-10信号和肿瘤促进功能相关的基因（图S8E和S8F）。在T细胞组分中，我们观察到激活的CD8+ T细胞数量显著增加，α-CTLA-4治疗进一步增强了这一效应。这些CD8+ T细胞表现出肿瘤特异性耗竭细胞的特征，如与过度扩增的TCR克隆体相关联，并表达几种激活/耗竭标记，如PD-1（Pdcd1）、TIM-3（Havcr2）、Ifng、CD39（Entpd1）、Itga1、Cxcr6和Prf1（图8F、8G和S8G）。联合治疗还增加了这些扩增T细胞的TCR克隆多样性，这可能是通过重新塑造的髓系组分促进抗原呈递的结果（图8H）。有趣的是，我们观察到，在扩增的T细胞克隆中，先前被描述为与肿瘤反应性和效应功能相关的基因表达水平有所提高（图S8H）。值得注意的是，在我们的第二次单细胞转录组分析中并未观察到Eomes CD4+ T细胞，这与对治疗有反应的小鼠的选择相一致。总之，这些发现证明了工程化肝脏巨噬细胞释放IFNα与靶向调节性T细胞功能的检查点阻断之间的强大协同作用。

为了确认IFNα-LV和α-CTLA-4联合疗法对结直肠癌转移瘤的治疗效果，我们用携带PDAC肝转移瘤（K8484细胞）的小鼠进行了实验。然而，单独使用IFNα LV或α-CTLA-4治疗均可有效抑制肿瘤转移的生长，但只有两者的联合治疗才在所有接受治疗的小鼠中实现了完全的CR（图8I和S8I）。

总的来说，这些发现证明了基于工程化肝脏巨噬细胞的IFNα递送以及针对调节性T细胞功能的CTLA-4阻断策略之间的强大协同抗瘤作用。

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