引用本文：孙本乐，路雪梅，张美玲，等.大鼠舌鳞状细胞癌病变过程中甲基转移酶16和甲硫氨酸腺苷转移酶2A表达变化研究[J].中国实用口腔科杂志，2024，17（4）：440-447. DOI：10.19538/j.kq.2024.04.011
摘要：目的 探究大鼠舌鳞状细胞癌（以下简称“舌鳞癌”）病变过程中甲基转移酶16（METTL16）、甲硫氨酸腺苷转移酶2A（MAT2A）的表达变化及意义。方法 研究于2022年6月至2023年5月在滨州医学院附属医院医学研究中心进行。选取48只6周龄雄性SD大鼠，随机分为研究组（40只）和对照组（8只），研究组再随机分为5个时间亚组，每亚组8只，饮用0.004% 4-硝基喹啉-1-氧化物（4NQO）水溶液诱导并构建舌鳞癌模型，分别于12、15、18、21、24周后切取舌背黏膜病变组织；对照组饮用纯净水，于24周后取材。观察研究组与对照组大鼠体质量及舌背黏膜形态等改变。采用HE染色观察大鼠舌背黏膜组织的病理学改变，并按照病变程度重新分组。采用免疫组织化学染色检测不同病变程度组METTL16、MAT2A的表达［平均光密度（AOD）值］。结果 随着诱导时间的增加，研究组24周亚组和对照组大鼠体质量均发生改变，且2组比较差异有统计学意义（均P < 0.05）。研究组大鼠舌背黏膜逐渐出现从白斑样病变到菜花样肿物的变化，并按照研究组和对照组大鼠舌背黏膜组织的病理学改变分为正常黏膜组（8只）、单纯增生组（10只）、轻度异常增生组（13只）、中重度异常增生组（8只）、舌鳞癌组（9只）。免疫组织化学染色结果显示，舌鳞癌组和中重度异常增生组METTL16的AOD值均大于正常黏膜组、单纯增生组和轻度异常增生组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；舌鳞癌组、中重度异常增生组和轻度异常增生组MAT2A的AOD值均大于正常黏膜组和单纯增生组，且舌鳞癌组MAT2A的AOD值还大于轻度异常增生组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。Pearson相关性分析显示，METTL16和MAT2A在不同病变程度组中表达呈正相关（r = 0.875，P < 0.001）。结论 METTL16和MAT2A在大鼠舌鳞癌病变过程中的表达呈动态变化，且与正常黏膜组织相比，二者均在中重度异常增生组织和癌组织中表达明显增加。METTL16和MAT2A可能协同促进大鼠舌鳞癌的发生和发展。
关键词：口腔鳞状细胞癌；甲基转移酶16；甲硫氨酸腺苷转移酶2A；生物标志物
口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，其约占口腔恶性肿瘤的90%，好发于舌部、颊部、口底、牙龈、腭部等部位［1］。目前，OSCC治疗相关研究较多，但临床OSCC患者死亡率一直居高不下［2］。因此，深入探索OSCC的发生发展机制，并寻找精准的诊断和治疗靶点具有重要意义。
近年来，RNA甲基化修饰成为了医学研究的热点。RNA甲基化修饰包括5-甲基胞嘧啶（5-methylcytidine，m5C）、N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine，m1A）、N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）、7-甲基鸟苷（N7-methylguanosine，m7G）和假尿嘧啶（pseudouridine，ψ）等多种形式［3］；其中，m6A修饰较为常见，其在胚胎发育、干细胞分化、免疫调控及肿瘤发生发展中的作用备受关注［4］。甲基转移酶16（methyltransferase 16，METTL16）是一种新发现的m6A甲基转移酶，研究表明其可调控目标RNA的稳定性，进而通过影响细胞周期转变［5］、促进糖酵解［6］、抑制铁死亡［7］等方式在不同肿瘤中发挥促癌或抑癌作用。METTL16还可通过与真核翻译起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）相互作用促进蛋白翻译，以不依赖其甲基转移酶活性的方式促进肿瘤的发生、发展［8-9］。
甲硫氨酸腺苷转移酶2A（methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A）是生成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）的关键酶，被认为是METTL16重要的甲基化底物［10］。研究发现，METTL16与MAT2A在胃癌组织、卵巢癌组织中均呈高表达，且二者的表达在上述两种癌组织中均存在相关性［11-12］。目前，关于METTTL16和MAT2A在OSCC中的作用尚不清楚，本研究拟采用4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitro-quinoline-1-oxide，4NQO）饮水法构建大鼠舌鳞状细胞癌（以下简称“舌鳞癌”）模型，并通过免疫组织化学染色检测METTTL16和MAT2A在病变过程中的表达，初步探索其在舌鳞癌发生发展中的作用，以期为OSCC的早期诊断和治疗提供新的思路和方向。
本研究于2022年6月至2023年5月在滨州医学院附属医院医学研究中心进行，经滨州医学院动物实验伦理委员会批准（批准号：20220128-125）。
1. 1 舌鳞癌模型构建与分组 选取48只6周龄雄性SD大鼠饲养于SPF级房间，随机分为研究组和对照组。其中，研究组40只，再随机分为5个亚组，每亚组8只，饮用0.004% 4NQO（上海源叶生物科技有限公司）水溶液诱导并构建舌鳞癌模型，分别于12、15、18、21、24周后观察病变情况并切取舌背黏膜组织；对照组8只，饮用纯净水，于24周后切取舌背黏膜组织。实验期间，密切观察大鼠的进食量、饮水量及精神活动状态，对研究组24周亚组和对照组大鼠每4周称重1次并记录。1. 2 舌背黏膜组织标本的收集与处理 腹腔注射盐酸氯胺酮注射液（100 mg/kg）麻醉大鼠，先观察并记录大鼠舌背黏膜形态、质地和颜色的改变，后沿大鼠舌背黏膜病变与正常组织交界处整块切取标本；若大鼠舌背黏膜无肉眼可见的病变，则切取舌背黏膜后1/3部分作为标本。将标本置于4%多聚甲醛固定溶液中固定，常规脱水透明、石蜡包埋、制备切片。1. 3 HE染色 石蜡切片按照HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）进行染色，光镜下观察组织病理学改变。参照世界卫生组织（WHO）分类标准［13］，将大鼠按照舌背黏膜组织病变程度重新分组：正常黏膜组、单纯增生组、轻度异常增生组、中重度异常增生组和舌鳞癌组。1. 4 免疫组织化学染色 将不同病变程度组按照免疫组织化学染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）说明书进行操作：石蜡切片常规进行脱蜡水化，PBS冲洗；EDTA抗原修复；滴加内源性过氧化物酶，室温孵育10 min，PBS冲洗；滴加适量一抗METTL16多克隆抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司）、MAT2A多克隆抗体（Proteintech公司，美国），37 ℃孵育1 h，PBS冲洗；滴加适量反应增强液，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗；滴加适量二抗，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗；滴加新鲜配制的DAB显色液，室温孵育5 ~ 8 min；流水冲洗，苏木素复染，分化，冲洗返蓝；脱水，透明，封片。每张切片光镜下随机选取5个高倍镜（× 200）视野拍照，ImageJ图像分析软件检测每张切片阳性染色的平均光密度（average optical density，AOD）值［14］，AOD值越高表示组织中待检测蛋白的表达量越高。1. 5 统计学处理 应用SPSS 26.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以“均数±标准差”表示。采用重复测量资料的方差分析比较研究组24周亚组与对照组大鼠的体质量变化；采用单因素方差分析比较不同病变程度组METTL16、MAT2A的AOD值，组间两两比较采用LSD检验；METTL16与MAT2A的关系采用Pearson相关性分析。P < 0.05为差异有统计学意义。2. 1. 1 体质量 自研究组诱导构建舌鳞癌模型始，每4周记录研究组24周亚组与对照组大鼠体质量结果见表1。经重复测量资料的方差分析示，随着诱导时间的增加，2组大鼠体质量均发生改变（F = 103.072，P < 0.001）；研究组24周亚组大鼠体质量低于对照组，差异有统计学意义（F = 51.907，P < 0.001），且此差异随诱导时间发生改变（F = 3.681，P = 0.017）。![]()
2. 1. 2 其他体征 对照组大鼠在饲养期间进食、饮水量无明显变化，精神活动状态佳，未出现明显异常。研究组大鼠在诱导构建舌鳞癌模型初期（0 ~ 4周），进食量同对照组无明显差别，饮水量明显少于对照组，精神状态较差，部分大鼠出现烦躁状态；随着诱导时间的延长，研究组大鼠进食量未出现明显改变，饮水量逐渐上升并趋于平稳状态，但仍低于对照组，精神萎靡，活动力下降；在诱导构建舌鳞癌模型后期（20 ~ 24周），研究组大鼠进食、饮水量均明显下降，精神状态极差，活动力明显下降，个别大鼠出现行动困难。2. 2. 1 肉眼观察 对照组：大鼠舌背黏膜呈粉红色，表面光滑平整，未见明显异常（图1a）。研究组：诱导后12周，大鼠舌背黏膜变粗糙，部分大鼠舌根部黏膜呈局限性发白增厚，略高出黏膜表面，即呈现白斑样外观（图1b）；诱导后15周，大鼠舌背黏膜粗糙程度加重，多数大鼠舌根部出现白斑样病变；诱导后18周，大鼠舌根部白斑样病变范围增大，呈乳白色，明显突出于黏膜表面，个别大鼠在白斑样病变内出现疣状突起；诱导后21周，多数大鼠舌根部出现多发白色斑块，表面粗糙不平，且可见分布不均的颗粒样突起，个别大鼠舌根部出现菜花样肿物（图1c）；诱导后24周，超过半数的大鼠舌根部出现菜花样肿物，表面出血坏死，周围口腔黏膜（上腭、舌腹、颊黏膜）出现多发性白色斑块，部分斑块中央有溃疡形成。![]()
2. 2. 2 光镜下观察 对照组大鼠舌背黏膜均为角化的复层鳞状上皮，组织层次清晰分明，基底细胞排列整齐，细胞无异型，均为正常黏膜组（8只）。研究组大鼠随诱导时间的延长，舌背黏膜出现从单纯增生、轻中重度异常增生到舌鳞癌的病理变化（图2）；其中，12周亚组发生单纯增生5只、轻度异常增生3只，15周亚组发生单纯增生3只、轻度异常增生4只、中度异常增生1只，18周亚组发生单纯增生2只、轻度异常增生3只、中度异常增生1只、重度异常增生1只、舌鳞癌1只，21周亚组发生轻度异常增生3只、中度异常增生1只、重度异常增生2只、舌鳞癌2只，24周亚组发生中度异常增生1只、重度异常增生1只、舌鳞癌6只；合计单纯增生组10只、轻度异常增生组13只、中重度异常增生组8只、舌鳞癌组9只。![]()
2. 3 不同病变程度组METTL16和MAT2A的表达 METTL16主要表达于细胞质和细胞膜，表现为棕黄或棕褐色。正常黏膜组主要表现为基底层细胞和棘层细胞较浅染色。随着病变程度的加重，单纯增生组、轻度异常增生组、中重度异常增生组、舌鳞癌组METTL16阳性染色逐渐加深，染色范围也逐渐扩展至上皮全层，在舌鳞癌组的癌巢中呈强阳性表达，弥漫性表达于癌细胞的细胞质和细胞膜。见图3。![]()
在正常黏膜组、单纯增生组、轻度异常增生组和中重度异常增生组中，MAT2A主要表达于细胞核，表现为棕黄或棕褐色。在正常黏膜组中，主要表现为基底层细胞和棘层细胞较浅染色，随着病变程度的加重，阳性着色逐渐加深，染色范围也逐渐扩展至上皮全层。在舌鳞癌组中，MAT2A的表达最强，在癌巢中呈强阳性表达，弥漫性表达于癌细胞的细胞核、细胞质和细胞膜，细胞质和细胞膜阳性染色的细胞数目明显增多。见图4。
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METTL16和MAT2A在不同病变程度组中AOD值总的比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。组间两两比较结果显示，舌鳞癌组和中重度异常增生组METTL16的AOD值均大于正常黏膜组、单纯增生组和轻度异常增生组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；其他组间METTL16的AOD值比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。舌鳞癌组、中重度异常增生组和轻度异常增生组MAT2A的AOD值均大于正常黏膜组和单纯增生组，舌鳞癌组MAT2A的AOD值还大于轻度异常增生组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；其他组间MAT2A的AOD值比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。见表2。Pearson相关性分析结果显示，METTL16和MAT2A在不同病变程度组中的表达呈正相关（r = 0.875，P < 0.001）。![]()
3 讨论
OSCC的发生发展是一个多阶段、多步骤的生物学过程，在致病因素的长期作用下，口腔正常黏膜组织经单纯增生、异常增生改变，最后发展为OSCC［15］。4NQO饮水法被证实是一种稳定可靠的大鼠舌鳞癌构建方法，能较好模拟人OSCC发生发展的过程［16］。本研究结果也证实，研究组大鼠随诱导时间的延长，舌背黏膜出现从单纯增生、轻中重度异常增生到舌鳞癌的病理变化。
METTL16作为一种新发现的m6A甲基转移酶，其在肿瘤中的作用备受关注，目前研究发现其与胃癌［5］、乳腺癌［7］、肝癌［8］等常见恶性肿瘤的发生、发展密切相关，但其在OSCC中的作用机制尚不清楚。本研究采用免疫组织化学染色检测其在不同病变程度组中的表达情况发现，舌鳞癌组和中重度异常增生组METTL16的表达均强于正常黏膜组、单纯增生组和轻度异常增生组，且舌鳞癌组和中重度异常增生组间METTL16的表达差异无统计学意义。提示，在癌前病变期METTL16的表达已发生较大变化，并可能在病变过程中发挥重要作用如下。①影响蛋白翻译：肿瘤的发生与蛋白翻译过程密切相关，翻译过程的加强可促进癌症相关蛋白及促癌因子的表达，从而导致肿瘤的发生。Su等［8］研究表明，METTL16可通过与eIF3a/b相互作用促进蛋白翻译，从而导致肿瘤的发生。目前研究已证实，eIF3a/b在OSCC的发生发展中具有重要作用［17-18］；由此推测，METTL16可能通过促进蛋白翻译导致OSCC的发生。②影响细胞的异常增殖：细胞的异常增殖是OSCC病变过程中的重要生物学特征之一。Gupta等［19］研究发现，与正常口腔黏膜相比，中重度异常增生和OSCC组织中的细胞增殖水平明显增强。Wang等［5］研究发现，METTL16可促进胃癌细胞的增殖，机制为通过m6A修饰增强细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）mRNA的稳定性来上调CCND1的表达，进而通过加速胃癌细胞G1/S期转变来促进胃癌细胞增殖。Ye等［7］研究发现，METTL16可促进乳腺癌细胞的增殖，其通过m6A修饰增强铁死亡的关键负调节因子［谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）］的表达水平，从而抑制铁死亡，促进乳腺癌细胞的增殖。由此推测，METTL16可能通过促进细胞的异常增殖，导致OSCC的发展。MAT2A是甲硫氨酸循环过程中的关键酶，其可催化甲硫氨酸和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）产生SAM，SAM是细胞内DNA、RNA及蛋白质甲基化过程的甲基供体［10］。MAT2A已被证实在胃癌、结直肠癌、肝癌等常见恶性肿瘤中呈高表达，且高表达的MAT2A与上述肿瘤的发生发展密切相关［20］，但其在OSCC中的作用机制尚不清楚。本研究结果显示，舌鳞癌组、中重度异常增生组和轻度异常增生组MAT2A的表达强于正常黏膜组和单纯增生组，且舌鳞癌组MAT2A的表达还强于轻度异常增生组，提示MAT2A也可能促进了OSCC的发生与发展，其作用机制可能如下。①影响甲基化状态：甲基化状态的改变与肿瘤的发生密切相关，如抑癌基因的高甲基化常导致基因沉默，促进肿瘤发生。有学者通过比较口腔正常组织、口腔白斑和OSCC中抑癌基因的甲基化表达量发现，OSCC中抑癌基因的甲基化表达量明显高于正常组织［21］，表明抑癌基因高甲基化可能在OSCC的发生中起到重要作用。MAT2A是生成细胞内甲基供体SAM的关键酶，故推测其可能通过调节SAM的代谢来影响抑癌基因的甲基化状态，从而促进OSCC的发生。②影响蛋白质合成：肿瘤的生长离不开蛋白质的合成，Villa等［22］研究发现，MAT2A对于癌细胞中蛋白质的生物合成至关重要，靶向抑制MAT2A可导致细胞内SAM表达下降，降低m6A修饰水平，抑制蛋白质合成率和肿瘤生长。由此推测，MAT2A亦可能通过加速蛋白质的生物合成，导致OSCC的进展。③影响肿瘤细胞侵袭性：Chu等［23］在一项乳腺癌研究中发现，MAT2A的亚细胞定位可能影响其功能，细胞质中MAT2A表达水平较高的乳腺癌细胞系更具侵袭性。而在本研究中，MAT2A在舌鳞癌病变过程中亦存在细胞内表达部位的改变，在单纯增生组和异常增生组中主要表达于细胞核，而在舌鳞癌组中细胞质和细胞膜阳性染色的细胞数明显增多，MAT2A亦可能与OSCC发生发展过程中细胞侵袭性的变化有关。虽尚无文献报道MAT2A对OSCC细胞侵袭性的影响，但有研究发现OSCC对甲硫氨酸具有高度依赖性，通过甲硫氨酸限制可明显抑制OSCC细胞增殖、迁移和侵袭［24］，而MAT2A是甲硫氨酸循环过程中的关键酶，且甲硫氨酸循环的发生场所为细胞质，故推测MAT2A在癌变过程中出现由细胞核到细胞质的易位，可能是通过影响甲硫氨酸的代谢进而导致OSCC的恶性进展，但以上推测均需进一步研究证实。
MAT2A与METTL16关系密切，METTL16可通过结合并甲基化MAT2A mRNA以实现对其表达水平的调控，从而调节细胞内SAM的变化［10］。但目前关于METTL16/MAT2A调控轴与肿瘤发生发展关系的研究较少，仅发现METTL16与MAT2A在胃癌组织、卵巢癌组织中呈高表达，且二者的表达在上述2种癌组织中均存在相关性［11-12］。在本研究中，二者在舌鳞癌病变过程中的表达呈正相关，提示METTL16与MAT2A可能在OSCC的发生发展中起到协同作用，但具体作用机制尚需进一步研究。综上所述，METTL16和MAT2A在舌鳞癌病变过程中的表达呈动态变化，且与正常黏膜组织相比，二者均在异常增生和癌组织中表达明显增加，表明二者可能在大鼠舌鳞癌病变过程中发挥癌基因的作用，且可能协同促进舌鳞癌的发生发展，关于二者的促癌机制尚需进一步探索。本研究尚有不足之处，仅在动物模型中检测METTL16和MAT2A在舌鳞癌病变过程中的表达情况，初步探索二者在舌鳞癌发生发展中的作用。之后计划检测二者在人口腔黏膜癌变不同阶段组织中的表达，并研究二者与OSCC患者的预后、转移等方面的关系；同时还将开展细胞实验，探索二者对OSCC细胞生物学特性的影响及在OSCC治疗中的应用。
