01
摘要
在双特异性抗体（bsAb）的生产过程中，非特异性配对导致bsAb产量低。已经开发了几种抗体工程技术来克服错配问题。本研究介绍了一种新颖的链配对方法“bsAb by external paired and excision”（BAPE），通过融合外部SpyCatcher/Tag和SnoopCatcher/Tag单元来诱导特定的链配对。然后通过蛋白酶裂解去除这些标记。本研究应用这种方法强制重链和轻链的正确配对，而重链配对是通过Knobs-into-Holes突变实现的。然后，我们确认了共价异肽键的链间桥的形成。anti-CD3/anti-Her2 和 anti-CD3/anti-EGFR双特异性抗体均具有良好的靶向结合活性和体外杀伤活性。
02
前言
bsAbs是经过遗传/化学修饰的抗体，可以同时结合两个不同的抗原。这种双特异性使bsAbs成为治疗几种疾病的有前景的药用工具。例如，针对癌症抗原和免疫细胞表面抗原的bsAb可桥接两个细胞，从而有效诱导抗癌免疫应答。IgG型bsAb是最受欢迎和研究最广泛的。然而，“错配问题”可使IgG型bsAb的生产复杂化。重链A和B之间的相似性，或轻链A和B之间的相似性，A和B可能会导致链间错配。为了克服错配问题，Knobs-into-Holes （KiH）突变和CrossMab是两种流行的方法来实现所需的链间配对。KiH通过在CH3二聚化界面上引入凹面/凸面实现正确的重链配对，而CrossMab通过交换Fab臂一侧的CH1/CL或VH/VL域实现重链和轻链之间的正确配对。虽然这些方法被广泛应用，但都需要引入新的突变或结构域重排。
本研究报告了一种用于生产双抗的新型链配对方法，该方法不需要人工修饰，而是融合外部链间配对单元。本文首先展示了如何通过外部配对实现重和轻链的特定配对。然后，使用SpyCatcher/Tag和SnoopCatcher/Tag蛋白对，通过名为“BsAb by external pairing and excision”的过程，在其N末端强制配对重链和轻链(BAPE，图1)。SpyCatcher/Tag和SnoopCatcher/Tag系统是一对蛋白分子，在特定的Catcher和标签序列之间自发形成分子间的异肽键。这两个单元是正交的，因此可以设计出特定的一锅反应。使用这个系统通过在每个链的N -末端融合Catcher/标签蛋白来形成正确的重/轻链配对。使用KiH突变进行重链配对。表达后，可通过蛋白酶消化去除外部的Catcher/Tag蛋白。
03
结果
BAPE介导的anti-CD3/anti-Her2双抗的设计
图2A显示了使用BAPE方案设计的anti-CD3/anti-Her2 bsAb。首先，选择了两个适用于制药应用的anti-CD3/anti-Her2 bsAb克隆。然后，将SpyCatcher/Tag和SnoopCatcher/Tag对融合到这些克隆的bsAb的N-末端，作为重/轻链配对的外部配对单元（图2A）。一个KiH突变被引入两个重链的CH3结构域，以形成正确的配对。在抗肿瘤抗体中引入了Knobs突变，在anti-CD3抗体中引入了holes突变。将SpyCatcher和SpyTag分别与anti-CD3抗体重链和轻链融合，而SnoopCatcher和SnoopTag分别与anti-Her2抗体重链和轻链融合，之后是凝血酶裂解位点。此外，VHH结构域被融合到所有4条双抗链的N端以增强重组表达。使用哺乳动物表达系统表达CD3-Her2(Spy-Snoop)和蛋白A柱纯化。图2B显示在200 kDa附近有一个带，这相当于通过Catcher/Tag蛋白共价连接的两条重链/轻链的大小（即anti-CD3为113 kDa，anti-Her2为118 kDa）。这表明在表达过程中发生了链间配对。
通过BAPE构建CD3-Her2 bsAb
接下来，进行凝血酶消化和蛋白L纯化，通过去除CD3-Her2的两个Catcher/Tag部分（Spy-Snoop），构建CD3-Her2 bsAb（图2B)。在25℃下进行消化反应过夜。消化后，共价连接的重/轻链复合物消失，出现重链和轻链的条带，表明的Catcher/Tag部分被成功移除。凝血酶消化后，在两条链的N端均保留了一个间隔GSHMHM序列。
使用SEC评估去除配对标签并使用蛋白A柱纯化后得到的CD3-Her2 bsAb的分子大小（图2C）。然后使用DSF测量BsAb稳定性（图2D），并且在61.7 ℃和 79.7 ℃处观察到两个峰。然后，通过流式细胞术分析评估了bsAb结合活性（图2E）。CD3-Her2双抗对两种细胞系均表现出显著的结合活性，证实了双抗的双重特异性。接下来，使用CD3-Her2 bsAb评估了T细胞介导的细胞毒性（图2F）。观察到的抗癌细胞活性表明，通过连接癌症和激活的免疫细胞，双特异性活性。
BAPE介导的anti-CD3/anti-EGFR双抗的设计
基于使用BAPE方案成功构建CD3-Her2 bsAb，随后评估了不同的bsAb组合。因此，将anti-EGFR抗体Cetuximab与anti-CD3抗体HuM291结合，通过BAPE构建了CD3-EGFR bsAb。SnoopCatcher和SnoopTag分别融合到Cetuximab抗体的重链和轻链的N-末端。此外，使用VHH结构域进行表达(图4A)。接下来，将两条重链和两条轻链的表达载体转染到哺乳动物细胞中。图4B显示了去除两个配对单元前（Lane 1）和去除后的（Lane 2）纯化的bsAb分子。在消化之前，可以观察到共价连接的重链和轻链的条带，从而表明形成了异肽键。经凝血酶消化后，原生重链和轻链对应的条带再次证明BAPE制备方法的成功。然后通过分析SEC评估CD3-EGFR bsAb的分子大小（图4C）。在IgG对照洗脱位置附近有一个主峰洗脱，表明目标bsAb分子形成成功。接下来，检查了CD3-EGFR bsAb的热稳定性并且将其Tm值确定为63.3℃。随后，通过流式细胞术评估了CD3-EGFR bsAb的结合活性（图4E），细胞图表明构建的分子对EGFR阳性和CD3阳性细胞均显示出结合活性。最后，通过与活化的T细胞（T-LAK）共培养来测定对EGFR阳性细胞的细胞毒活性。图4F显示生长抑制活性相对于bsAb浓度呈浓度依赖性增加。
04
结论
本研究报道了一种新型的链配对方法BAPE的开发，该方法用于构建bsab。在BAPE中，外部SpyCatcher/Tag和SnoopCatcher/Tag单元诱导目标链配对，由于具体配对是由外部启用，因此可以在不修改bsAb本身的情况下实现目标配对，这与现有的配对方法相比是一个优势点。因此，鉴于简单性在促进工业用途的大规模生产方面的重要性，BAPE可能是的优势。虽然重组表达水平仍然不够，但使用组成型表达系统，例如CHO表达系统可以解决这个问题。
05
文章信息
期刊：Biological Engineering
DOI: 10.1186/s13036-024-00454-z
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39402666/
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