哈兽研：聚合酶酸性蛋白n端区域的两个氨基酸残基决定了欧亚鸟样H1N1猪流感病毒对小鼠的毒力

2024年08月30日，哈尔滨兽医研究所研究团队在Journal of Virology上发表题为“Two amino acid residues in the N-terminal region of the polymerase acidic protein determine the virulence of Eurasian avian-like H1N1 swine influenza viruses in mice”的最新研究论文，本研究旨在探究两个自然分离的 rEA H1N1 猪流感病毒在小鼠模型中表现出不同毒力的分子基础，并揭示了决定 rEA H1N1 病毒毒力的关键分子决定因素，以及这些决定因素如何影响病毒 RNA 的转录和复制。

图1.FX38病毒与SY72病毒的遗传同源性分析及氨基酸差异

图2.FX38 和 SY72 病毒的系统发育分析

图3.FX38 和 SY72 病毒对小鼠的毒力

2.PA基因是决定病毒复制能力和聚合酶活性的关键因素

在这项研究中，PA基因被确定为决定rEA H1N1病毒复制能力和聚合酶活性的关键因素。研究者通过在MDCK细胞中比较FX38和SY72病毒的复制特性，发现FX38病毒的PA基因替换为SY72病毒的PA基因后，显著增强了病毒的复制能力。此外，通过在HEK293T细胞中测定FX38和SY72病毒的vRNP复合物的聚合酶活性，发现SY72病毒的聚合酶活性显著高于FX38病毒。通过构建包含FX38和SY72病毒PA基因的重组vRNP复合物，研究人员进一步证实了PA基因在聚合酶活性中的核心作用。这些结果强调了PA基因在调控病毒复制和转录过程中的重要性，并可能对病毒的毒力和传播能力有直接影响。

图4.确定影响病毒复制能力和聚合酶活性的基因片段

3.PA 中 100 和 122 位氨基酸突变会改变病毒复制能力和聚合酶活性

研究显示，聚合酶酸性蛋白（PA）的第100和122位点的氨基酸突变对欧亚类禽H1N1猪流感病毒在小鼠中的毒力有决定性影响。具体来说，PA蛋白的第100位和122位的氨基酸突变在体外对聚合酶活性和病毒复制能力有单独和协同作用。研究人员通过反向遗传学方法，构建了携带不同PA基因突变的重组病毒，并测试了它们在体外的复制能力和聚合酶活性。结果显示，PA蛋白第100位的氨基酸改变会影响病毒RNA（vRNA）的转录，而第122位的氨基酸则会影响互补RNA和信使RNA的合成。这些发现揭示了这两个位点的突变如何通过改变PA蛋白的内切核酸酶活性和RNA结合能力，进而影响病毒RNA的转录和复制，从而决定了病毒的毒力。

图5.确定 PA 中影响病毒复制能力和聚合酶活性的氨基酸残基

4.PA 中 100 和 122 位的两个氨基酸是病毒对小鼠致病性的关键决定因素

在这项研究中，位于PA蛋白第100和122位的两个氨基酸被证实是病毒在小鼠模型中致病性的关键决定因素。通过构建携带特定氨基酸替换的重组病毒，研究人员发现，这两个位点的突变不仅单独影响病毒的致病性，而且当两者同时发生突变时，还能产生协同效应，显著改变病毒的致病性。具体来说，第100位的氨基酸突变影响了病毒RNA的转录，而第122位的突变则影响了互补RNA和信使RNA的合成。这些发现为理解流感A病毒的毒力提供了新的分子机制见解，并可能有助于开发针对这些关键位点的抗病毒策略。

图6.PA蛋白100和122位氨基酸取代对FX38和SY72病毒在小鼠体内致病性的影响

5.PA 中 100 和 122 位的两个氨基酸突变影响 vRNA 的转录和复制

在这项研究中，PA蛋白第100和122位的两个氨基酸突变被发现能够影响病毒RNA（vRNA）的转录和复制。研究人员通过构建含有这些突变的重组病毒，并在细胞模型中进行测试，发现这些突变对vRNA的转录和复制过程有显著影响。具体来说，第100位的氨基酸突变通过改变PA蛋白的内切核酸酶活性，影响了vRNA的转录；而第122位的氨基酸突变则通过改变PA蛋白的RNA结合能力和内切核酸酶活性，影响了互补RNA（cRNA）和信使RNA（mRNA）的合成。这些发现揭示了这两个位点的突变如何通过影响PA蛋白的功能，进而调控病毒的基因表达和复制，这对于理解病毒的复制机制和毒力调控具有重要意义。

图7.野生型 SY72-PA、FX38-PA 及其各自突变体介导的体内 RNA 合成

6.PA 中的氨基酸残基 100 和 122 通过不同的机制参与病毒转录和复制

在这项研究中，PA蛋白的第100和122位氨基酸残基通过不同的机制参与了病毒的转录和复制过程。第100位的氨基酸残基主要通过影响PA蛋白的内切核酸酶活性，进而影响vRNA的转录过程。相比之下，第122位的氨基酸残基则通过影响PA蛋白的RNA结合能力及其内切核酸酶活性，参与调控cRNA和mRNA的合成。这些不同的分子机制表明，PA蛋白的这两个位点在病毒生命周期中扮演着复杂而关键的角色，它们的变化可能会对病毒的复制效率和宿主范围产生显著影响。这项研究的发现为深入了解流感病毒的复制机制和开发新的抗病毒策略提供了重要的分子基础。

图8.PA 中氨基酸残基 100 和 122 在病毒转录和复制中发挥作用的机制

7.H1N1 PA蛋白100和122位氨基酸多态性分析

在这项研究中，对H1N1病毒的PA蛋白第100和122位的氨基酸多态性进行了分析。通过对比不同宿主来源和谱系的H1N1病毒的PA序列，研究者发现这两个位点的氨基酸存在显著的多态性。具体来说，第100位的氨基酸在2009年至2023年间的人类源H1N1/2009病毒中，从最初的Val（缬氨酸）逐渐转变为Ile（异亮氨酸）。类似的变化也出现在猪源H1N1/2009病毒中。此外，第100位的氨基酸在经典猪H1N1、纯EA H1N1和禽H1N1流感病毒中以Val为主，而在人类季节性H1N1流感病毒中以Ala（丙氨酸）为主。至于第122位的氨基酸，Val（缬氨酸）在这个位点上高度保守，而在本研究所分析的H1N1病毒中，没有检测到L122L（亮氨酸）的变异，除了FX38病毒株。

8.PA 蛋白中的单个 V100A 或 V100I 替换可增强人源 rEA H1N1 病毒的聚合酶活性

为了研究其他病毒 PA 中氨基酸残基 100 的生物学功能，我们将突变 V100I 或 V100A 引入人源 rEA H1N1 病毒 的 PA 基因中，该病毒在 C57BL/6 J 小鼠中表现出高毒力 。然后，我们测试了 HuN42443 病毒的野生型 vRNP 和含有突变 PA 蛋白的重构 vRNP 的聚合酶活性，与 HuN42443 的 vRNP 相比，带有 HuN42443PA100A 和 HuN42443-PA100I 的重构 vRNP 的聚合酶活性在 33°C 时分别增加了 1.9 倍和 16.9 倍，在 37°C 时增加了 1.8 倍和 6.1 倍。

图9.PA 蛋白第 100 位单个氨基酸取代对重组 vRNP 聚合酶活性的影响

本研究深入探讨了欧亚类禽H1N1猪流感病毒在小鼠模型中的毒力决定因素，特别关注了聚合酶酸性蛋白（PA）的第100和122位氨基酸残基。研究发现，这两个位点的自然变异对病毒的聚合酶活性、复制能力和在小鼠中的致病性有显著影响。通过反向遗传学方法，研究者证实了PA蛋白上的特定氨基酸突变可以单独和共同作用，影响病毒的转录和复制过程，从而改变病毒的毒力。

研究揭示了第100位氨基酸残基通过改变PA蛋白的内切核酸酶活性，影响病毒RNA的转录，而第122位氨基酸残基则通过影响PA蛋白的RNA结合能力和内切核酸酶活性，参与调控互补RNA和信使RNA的合成。这些发现提供了对流感A病毒PA蛋白在病毒复制和致病性中作用的新见解，并有助于理解病毒如何通过这些关键氨基酸残基的变异适应宿主环境。

此外，通过对不同宿主来源的H1N1病毒PA蛋白的多态性分析，研究者发现第100位和122位氨基酸在不同病毒株中存在差异，这可能与病毒的宿主适应性和进化有关。这些多态性数据为流感病毒的进化监测和疫苗设计提供了重要的基础信息。总之，本研究不仅增进了我们对流感病毒致病机制的理解，而且为未来可能的病毒大流行提供了科学预警和防控策略。

  https://journals.asm.org/journal/jvi 

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