【文献阅读038】绘制肝脏免疫景观确定单核细胞来源巨噬细胞是脂肪性肝炎和胆管病进展的关键驱动因素

✦Significant increase in immune cell infiltration is associated with chronic liver disease progression.

✦Intense immune cell accumulation is observed in periportal areas in livers from NASH and PSC patients.

✦Transcriptomic analyses confirm differential myeloid, lymphoid, and fibrogenic signatures during disease progression in NAFLD and PSC patients.

✦IBA1 represents a pan-macrophage marker to capture heterogeneous macrophage populations in human NASH and PSC.

✦Studies of mouse NASH and PSC models reveal the predominant monocytic origin and spatially defined phenotypes of IBA1+ liver macrophages in disease conditions.

✦IBA1+ macrophages accumulating in the vicinity of CK19+ ductular cells display lower expression of polarization markers.

✦Unbiased multiparameter analysis reveals myeloid immune signatures for liver disease staging.

✦Application and validation of immune multiplexing in NASH, PSC, AH, and primary biliary cholangitis clinical samples.

背景与目的：慢性肝病向肝硬化发展伴随着很大的组织改变。本研究结合了复杂的转录组学和组织学方法，旨在从空间上解决非酒精性脂肪肝病NAFLD（包括非酒精性脂肪性肝炎NASH、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性胆管炎和严重酒精性肝炎）的肝脏免疫微环境。

方法和结果：对3个独立患者队列的人肝脏样本进行RNA测序（n=225）和细胞成像（n=99）。使用酒精性肝炎和原发性胆汁性胆管炎患者的肝脏标本作为对照。在相应的小鼠模型中进一步表征髓系群体。影像、临床和表型数据结合起来进行多维分析。NAFLD/NASH和原发性硬化性胆管炎疾病分期与实质区域丧失、导管细胞积聚增加和免疫细胞浸润相关。NASH患者主要表现为髓样细胞积聚，而原发性硬化性胆管炎患者有明显的淋巴样细胞反应。与疾病分期相关，两种病因在非实质区域显示强烈的IBA1⁺ CD16^lowCD163^low巨噬细胞聚集，与导管细胞有明显的空间接近。小鼠模型显示，疾病相关的IBA1+肝巨噬细胞起源于骨髓来源的单核细胞。使用无偏倚的，基于机器学习的算法，IBA1联合肝细胞和胆管细胞免疫染色预测人类NASH、原发性硬化性胆管炎和酒精性肝炎的晚期肝硬化。

结论：肝细胞损伤和导管反应增加与单核细胞来源的巨噬细胞积累密切相关，是揭示NAFLD、原发性硬化性胆管炎、原发性胆道性胆管炎和酒精性肝炎进展的最突出的共同免疫学特征，表明IBA1⁺ CD163^low巨噬细胞是多种病因下人类肝病进展的关键疾病驱动因素。

多种病因的慢性肝病可发展为纤维化，并可能最终导致肝硬化，伴肝功能衰竭或肝癌。NAFLD是最常见的肝脏疾病，并可能发展为NASH，最终发展为HCC。目前的趋势清楚地表明，NAFLD对全球卫生的负担正在迅速增加。酒精相关性肝病是世界范围内慢性肝病的另一个主要病因，包括严重酒精性肝炎（AH）。原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种具有高度可变病程的进展性胆管病，目前几乎没有可行的治疗方案。在晚期，PSC患者发生肝硬化、HCC和胆管癌的风险很高。

NASH、PSC和AH的特点是持续的纤维化和慢性肝脏炎症。临床前啮齿动物模型有助于了解不同疾病阶段炎症途径的功能相关性。利用单细胞RNA测序技术，我们和其他人证明了饮食诱导的NASH模型小鼠肝脏巨噬细胞室的巨大变化。例如，与正常饮食动物分离的细胞相比，西式饮食喂养后的肝巨噬细胞显著降低了s100a8和s100a9 mRNA的表达，这可能是一种防止过度炎症的适应。在NASH、AH和PSC等慢性肝脏疾病中观察到的胆管反应，其特征是类似于未成熟胆道细胞的肝祖细胞增殖，并依赖于IL-17A和巨噬细胞驱动的炎症。在急性靶向胆道上皮细胞死亡模型中，我们最近发现C-C趋化因子受体2型（CCR2+）单核细胞来源的巨噬细胞在促进局部炎症和胆管修复中至关重要。因此，巨噬细胞活化与疾病进展之间存在内在联系，需要进一步研究。

在NASH、PSC和AH中，炎症在疾病进展中的不同作用（有时是相反的作用）已被研究。然而，我们目前对人类肝脏疾病中不同免疫细胞的空间分布及其与疾病进展的关系缺乏了解。

在这项研究中，我们建立了一种多管齐下的方法来绘制NAFLD、NASH、PSC、AH或原发性胆汁性胆管炎患者肝脏中发生的免疫景观。我们进一步评估了NASH和PSC小鼠模型，比较了在这些条件下不同的肝巨噬细胞亚群及其空间分布。我们旨在确定疾病进展（如纤维化）的潜在关键免疫驱动因素，以及疾病特异性免疫特征。

健康状态下或疾病期间肝脏中存在的免疫细胞的复杂性和异质性，以及它们与实质细胞和非实质细胞的潜在相互作用，最近通过在单细胞水平上进行详细的转录组学和蛋白质组学分析，成为主要的研究重点。这些研究确实揭示了以前被忽视的肝脏特定疾病阶段免疫细胞表型的多样性。由于这些原因，多参数分析似乎特别适合全面解读发病机制。然而，这些发现尚未转化为针对进行性肝病的新型免疫靶向疗法。此外，大多数研究将着眼于少量样本（小鼠或人类），或独立研究NASH、PSC、原发性胆道炎和AH，然而，在这里，我们旨在整合来自大型队列的数据，以找到常见的疾病进展标志，这将指向对最相关的细胞疾病驱动因素的全面观点，这些驱动因素可以随后作为治疗靶点进行探索。

我们的数据强调，CD20+ B淋巴细胞和CD3+CD4+Foxp3+ T淋巴细胞的存在似乎是PSC的特征，而不是晚期NASH的特征，这可能归因于疾病的性质。重要的是，我们的分析迅速鼓励我们关注多种晚期肝脏疾病的髓系成分。事实上，通过提供基于机器学习的工具来评估大型患者队列的炎症和组织学变化，我们的方法使我们能够强调随着NASH和PSC进展的骨髓源性巨噬细胞的强大积累和表型异质性。引人注目的是，IBA1+巨噬细胞以及CK19+胆管细胞的空间分布、空间分布激活标志的表达等特征是NAFLD、NASH和PSC中严重肝脏疾病的最常见标志。该分析支持对空间分辨免疫细胞表型的需求，与需要组织解离的方法（例如，流式细胞术，离体单细胞RNA测序）相比，它带来了新的见解。有趣的是，我们的研究结果表明，IBA1水平在多个肝巨噬细胞群体中是稳定的（即，不同功能标志物的表达、大小和空间分布）。这使我们得出结论，IBA1的表达本身不会受到很大的表达调控，至少在肝脏疾病中是如此，尽管早期的研究发现IBA1在巨噬细胞膜皱褶和促炎信号通路如NF-κB中是必需的。我们的数据还表明，我们的统计学习模型可以很好地应用于NASH和PSC之外，例如AH，另一种具有导致肝硬化的强免疫反应的进行性肝病，以及临床前模型，例如，用于药物治疗验证。未来的研究可能会评估我们的方法在其他条件下的相关性，可能需要根据病因进行一些模型调整。

我们研究的另一个惊人发现是髓细胞、纤维细胞和导管细胞之间的复杂关系。这是高度相关的，因为CD163^lo巨噬细胞与肝硬化结局的强烈关联最近被证实。同样，在PSC中，CCL28+巨噬细胞在导管细胞附近聚集。同样，来自人类肝脏的单细胞RNA测序发现，纤维化肝脏中的巨噬细胞数量增加，并与胶原生成细胞相互作用，尽管这些数据自然依赖于有限数量的样本。此外，guillams等最近报道了肝脏巨噬细胞群的异质性，并证明了在稳态过程中存在胆管相关巨噬细胞群，这些巨噬细胞群具有脂质相关巨噬细胞的特征，并在肝硬化肝脏中扩大，并提出了抗炎作用。这与我们之前的工作一致，在我们的工作中，我们证实了单核细胞来源的巨噬细胞在诱导门静脉区局限性肝脏炎症和急性胆管修复以及靶向胆管上皮细胞损伤中的直接作用。由于骨髓细胞似乎在肝脏疾病进展的多个方面至关重要，包括炎症、纤维生成和导管反应，以往的研究和目前的工作支持需要重新考虑骨髓细胞靶向治疗。例如，CCR2/CCR5拮抗剂在临床前模型和2b期临床试验中有效地减少了NAFLD/NASH的纤维生成，但在更大的队列中未能达到令人满意的疗效。因此，应该研究其他的、多靶点的巨噬细胞调节方法来预防慢性肝病的进展。一个潜在的方向可能是利用细胞间的相互作用，例如，在炎性和纤维化区域纤维细胞-髓系细胞的互作。

由于组学领域的快速技术进步和越来越多地使用计算资源进行多维和复杂的数据分析，当前的研究和临床环境正在以前所未有的速度发展。虽然这些研究中的许多都集中在免疫细胞亚群和疾病机制的异质性上，但我们的大规模和经济有效的方法产生的数据包括从组织的观察（例如，非实质区域的大量炎症浸润）到单个细胞特征（例如，表型标记物表达和细胞大小），以及不同的细胞类型之间的空间距离。我们的发现强烈建议进一步研究巨噬细胞在不同病因的晚期肝病中的靶向治疗。