BT丨江南大学邓禹团队：动态调控和辅因子工程增强大肠杆菌从玉米秸秆水解物生产乙醇酸

乙醇酸广泛应用于化学清洗，以及聚乙醇酸-乳酸和聚乙醇酸的生产。目前乙醇酸的生产依赖于刺激性、致癌性和消耗性的石化产品，引发了人们对这些来源的乙醇酸的担忧。通过改造工程微生物从木质纤维素等生物质中合成乙醇酸是环境友好的替代方案，这种方案因为成本低、环境友好并能够减少对化石产品的依赖而广受关注。常见的代谢工程的策略，如静态干预：通过过度表达途径基因和消除竞争途径基因用于过量生产产物。然而，这些静态调控策略不可避免地会导致细胞代谢流和能量失衡、生长迟缓和中间体的积累。相反，基于生物传感器设计的合适的动态代谢调节可以通过考虑细胞内和细胞外条件来精确控制代谢通量。此外，由于乙醇酸合成过程中需要辅因子NADPH的参与，NADPH的短缺同样会限制乙醇酸的合成。

因此，基于此背景，该研究为了解决乙醇酸生物合成中代谢通量不平衡和NADPH短缺的问题，创建了一组对乙醇酸敏感的生物传感器，并使用利用这些生物传感器设计了一个动态调节系统来协调乙醇酸的生产和细胞生长。此外，还建立并优化了一种异源的高活性ED途径，以提高NADPH的再生率。最后构建了一株可以利用木质纤维素为原料高产乙醇酸的工程大肠杆菌。

乙醇酸生物传感器由四个组件组成：转录激活剂glcC、glcC结合位点、整合宿主因子(IHF)结合位点和弱启动子P_glcD。当乙醇酸与GlcC结合时，GlcC启动RNA聚合酶的募集，并与其DNA结合位点结合。该过程增强了弱启动子P_glcD的转录强度。虽然该传感器可以识别乙醇酸并改变启动子的强度，然而实现最佳生产力需要不同基因。的不同表达水平。为了解决上述问题，该研究开发了梯度诱导的P_glcD启动子库用于多层次调控不同基因的表达。

该研究对P_glcD的-10区和-35区进行了改造，并设计了一个P_glcD启动子库（P_glcD-xy），其中考虑了RNA聚合酶与P_glcD-10区和-35区之间的结合能强度。这些启动子具有不同的基础表达水平和最大活化表达水平，它们具有有效调控乙醇酸生物合成途径、动态增加乙醇酸产量的潜力。

图1 设计P_glcD启动子的-10和-35区用于调节乙醇酸生物传感器的基础表达水平和最大活化表达水平

基于上述结果和作者的以往研究，建立了一个乙醇酸生产的动态调控系统。具体来说，选取基础表达水平与PUTR_infC-rplT和PUTR_gltA启动子(该作者以往研究中的启动子)相似或更高的P_glcD-xy启动子(该节中将这些启动子分组并命名为P_glcD-α与P_glcD-β)，构建一系列调控基因gltA和ycdW-aceA的生物传感器。利用该动态调控系统，P_glcD-α和P_glcD-β启动子首先正常进行组成性表达，在前期以基础表达水平积累乙醇酸；随着细胞生长，积累的乙醇酸增加了P_glcD-α和P_glcD-β启动子的转录强度，将更多的碳通量引导到乙醇酸合成途径同时不影响细胞生长。经过优化，获得了最佳菌株Mgly7-24，该菌株由P_glcD-B1启动子控制gltA和ycdW-aceA，在摇瓶中乙醇酸滴度为4.1 g/L（理论产量的61.3%）。

图2 动态调节策略用于放大代谢通量并强化乙醇酸生产

1 mol葡萄糖生产2 mol乙醇酸需要消耗2 mol还原辅因子NADPH。然而，胞内NADPH不足限制了乙醇酸的生产。为了增加NADPH的产量，在Mgly7-24中过表达来自大肠杆菌的吡啶核苷酸转氢酶（pntAB），得到菌株Mgly7-241。菌株Mgly7-241中的NADPH/NADP⁺比与Mgly7-24相比提高了15.4 %，乙醇酸产量提高到4.8 g/L。随后，为了阻止NADPH向NADH转化，在Mgly7-241中敲除了sthA，得到菌株Mgly8-241。Mgly8-241中的NADPH/NADP⁺比与Mgly7-241相比增加了3.3 %，乙醇酸滴度增加至4.9 g/L。此外，引入ED途径可以产生额外的NADPH。因此，该研究将大肠杆菌来源(EcED)和Z. mobilis来源的ED途径(ZmED)引入Mgly8-241。结果表明，EcED并无明显效果，而ZmED可将NADPH/NADP⁺比和乙醇酸滴度分别增加38.7 %和4.1 %。作者进一步对考察了不同表达强度的ZmED对NADPH/NADP⁺比和乙醇酸滴度的影响，结果表明，尽管高强度的ZmED能够提高菌株的NADPH/NADP⁺比，但并未带来乙醇酸滴度的提升。作者还考察了阻断糖酵解途径(EMP)对乙醇酸产量的影响：EMP途径大量生产了对菌株生长至关重要的ATP和必需中间体，敲除pgi后菌株的乙醇酸滴度降低。

图4 NADPH工程用于提高乙醇酸的产量

为了利用玉米秸秆水解物作为乙醇酸生产底物，该研究通过删除Mgly8-245中的ptsG来消除大肠杆菌的中心碳代谢抑制(CCR)，得到Mgly9-245菌株。这种修改使Mgly9-245能够共同利用葡萄糖和木糖。然而，ptsG的敲除影响了磷酸转移酶系统，导致葡萄糖利用率降低，菌株生长缓慢，乙醇酸滴度降低。因此，该研究通过引入来自Z. mobilis的异源葡萄糖促进基因（glf）用于恢复葡萄糖吸收能力，得到菌株Mgly10-245。结果表明，Mgly10-245的葡萄糖消耗率相较Mgly9-245增加50%，且乙醇酸的产量增加了23.5%。这表明葡萄糖吸收是消除CCR后的主要限制，增强葡萄糖吸收将显著提高乙醇酸的滴度和产量。

随后，作者在玉米秸秆水解液中发酵并对比上述菌株的乙醇酸产量。结果表明，消除了CCR的Mgly10-245能有效利用玉米秸秆水解液中的葡萄糖和木糖，最终乙醇酸滴度为4.9 g/L。而未消除CCR的Mgly8-245在利用玉米秸秆水解液为底物时，最初只能利用葡萄糖，导致木糖利用不足，乙醇酸滴度为4.0 g/L。值得注意的是，当Mgly10-245从葡萄糖转换为玉米秸秆水解物作为碳源时，其生长受到影响，乙醇酸滴度从5.0 g/L降低到4.9 g/L。这可能是由于水解物中存在抑制物质糠醛和盐，影响了工程菌株的代谢，导致Mgly10-245的OD₆₀₀和乙醇酸滴度降低。

为了提高木糖利用效率，在Mgly10-245中过表达转录因子xylR及其突变体（xylR^R121C），分别得到Mgly10-246和Mgly10-247菌株。12小时内，Mgly10-245、Mgly10-246和Mgly10-247的木糖利用率分别为0.1、0.2和0.3 g/L/h。然而，Mgly10-246 和Mgly10-247 中的葡萄糖利用率和乙醇酸滴度均下降。

图5 工程菌株中细胞生长、糖消耗和副产物积累

为了进一步提高乙醇酸的产量，以葡萄糖为唯一碳源，对大肠杆菌Mgly10-245进行了补料分批发酵。得到了迄今为止最高的乙醇酸产量（52.2 g/L），发酵时间为61.5小时（理论产量的90.5%）并且未添加诱导剂IPTG。随后，以玉米秸秆水解物为底物在 5 L 发酵罐中进行发酵。结果表明，Mgly10-245在70.3 h时乙醇酸滴度达到46.1 g/L（为理论产量的77.1%） 。

图6 Mgly10-245以葡萄糖或玉米秸秆水解物为底物的分批补料发酵