NC丨中科院大连化物所周雍进团队：啤酒花生物活性成分黄腐酚在酵母中的从头合成

黄腐酚是一种烯丙基类黄酮，具有多种生物活性，如预防癌症、预防和减轻糖尿病，并具有抗氧化、抗炎、抗菌和免疫调节作用。然而，啤酒酿造过程中黄腐酚的低浓度和不稳定性使得人们无法通过摄入啤酒获益黄腐酚这些药理作用。此外，啤酒花黄腐酚的提取也受原料短缺的限制，提取过程中的固体废料以及溶剂废料同样给环境带来了一定压力。因此，该研究基于以上背景，该研究通过平衡三大代谢途径并将黄腐酚关键前体去甲基黄腐酚(DMX)的产量提高了83倍，最终实现了黄腐酚在酵母中的从头生物合成。

图1 酵母中黄腐酚从头合成的工程代谢途径

黄腐酚生物合成途径的模块化构建

该研究首先在酿酒酵母中构建了黄腐酚从头合成途径，表达了几个关键基因：包括来自Flavobacterium johnsoniae的FjTAL和多个来自Humulus lupulus的基因（HlCCL12、CHS_H1、HlPT1L、HlCHIL2和HlOMT1）。然而，菌株YS103合成了柚皮素查尔酮和柚皮素，但未检测到去甲基黄腐酚(DMX)或黄腐酚。这表明DMX的合成或前体合成可能存在限制。因此，作者从上游途径着手，以提高前体L-酪氨酸、丙二酰辅酶A和DMAPP的合成：

1.敲除ARO10，过表达抗性基因ARO4^K229L和ARO7^G141S提高酪氨酸供应，得到的菌株YS107柚皮素查尔酮以及柚皮素的滴度提高了52%。2. 强启动子过表达ACC1以增加丙二酰辅酶A的供应，未能提高柚皮素查尔酮以及柚皮素（NC/N）的滴度。3. 过表达tHMG1和IDI1（甲羟戊酸途径中限速步骤的相关基因）未能产出DMX，可能是由于DMAPP和FPP生物合成的竞争。为了解决这个问题，该研究表达了突变的ERG20（ERG20^N127W），提高了DMAPP的可用性，得到的菌株YS116成功合成了12 μg/L的DMX。该研究进一步通过使用高拷贝质粒过表达HlPT1L基因（编码链霉素），DMX产量在YS117菌株中提高至104 μg/L，结果表明异戊二烯转移酶（PTase）是该途径的限速酶。

图2 优化去甲基黄腐酚的从头合成途径

异戊二烯转移酶的表征和工程改造

基于前述结论，考虑提高PTase的活性。由于植物中的PTase被靶向到高pH质体中，而酵母胞质pH较低，作者推测这种pH差异可能限制了PTase在酿酒酵母中的异源表达活性，因此在MES缓冲培养基中的培养了菌株YS116。72小时的培养后，缓冲介质中的DMX产量比未缓冲介质高2.8倍，同时观察到柚皮素查尔酮全部转化为柚皮素（柚皮素查尔酮的开环构象在高pH不稳定）。

为了获得更高活性的PTase，该研究从多种植物中筛选了可能对DMAPP和黄酮类底物起作用的PTase，通过氨基酸序列比对构建了系统发育树，结果表明HlPT1L与CsPT4位于同一分支，说明它们的催化功能相似。使用高拷贝质粒将12种密码子优化的PTase和HlPT1L基因分别表达在YS116菌株中。结果表明，表达MaIDT、HlPT1和LaPT1的菌株比表达HlPT1L的菌株产生更多的DMX，其中LaPT1产量最高，达到121 μg/L。

该研究进一步使用信号肽预测软件TargetP对PTase进行N端信号肽截短以改善酶活性。将截短的PTase序列与全长序列分别在YS116菌株中表达，评估DMX的产量。结果表明，截短的HlPT1L、MaIDT和LaPT1都提高了DMX产量，而截短HlPT-1反而降低了DMX产量。最终，截短版HlPT1L_Δ1-86被选定用于后续实验。

图3 PTase工程改造以提高DMX的产量

DMX生物合成的途径优化

为了增加DMX的重要前体DMAPP的供应，对MVA途径进行了优化。通过将ERG20^N127W基因的启动子替换为HXT1或ERG1基因的启动子，构建了菌株YS119和YS120，分别使DMX产量提高了2倍和1.4倍（与YS116相比）。然而，这些改造并未增加NC/N前体的产量，反而导致细胞生物量减少。此外，过表达ERG10和突变的HMG2^K6R后，菌株YS121的DMX产量相比YS116提高了1.9倍。进一步将两个拷贝的HMG2^K6R整合到菌株YS123后，DMX产量相比YS121又增加了34%。然而，过度表达导致NC/N前体的产量略有下降，这表明过量的代谢通量流向MVA途径，消耗了乙酰辅酶A，从而减少了对丙二酰辅酶A的合成。该研究尝试引入异戊烯醇利用途径（IUP）途径，通过缓解中央碳代谢的代谢应激来供给DMAPP，然而，添加异戊烯醇后IUP的表达并没有提高DMX的产量，同时还降低了前体NC/N的生物合成。

由于未检测到对香豆酸(p-CA)，作者推测前体对香豆酸供应不足。通过补充对香豆酸显著提高了DMX的产量，尤其是在24小时内添加280 mg/L的p-CA时，DMX的产量提高了2.2倍，且没有对香豆酸残留，这表明所有的对香豆酸都转化为对香豆酸辅酶A。随后，该研究尝试通过在菌株YS116中过表达下游CHS_H1和HlCHIL2来促进对香豆酸辅酶A向柚皮素查尔酮的转化，菌株YS125的DMX和NC产量分别提高了2.1倍和1.8倍，表明通过这些途径引导代谢流可以增加DMX和NC的合成。

虽然上述策略提高了DMX的产量，但DMX的滴度仍然很低，该研究进一步表达了HlPT1L_Δ1-86的两个额外拷贝，使菌株YSC1的DMX产量提高到184 μg/L，仅提升了23%的DMX产量。观察到NC/C产量充足，作者推测下游DMX合成通量不足。作者进一步将将IDI1与HlPT1L_Δ1-86融合，以促进DMAPP与PTase快速相互作用。将两拷贝融合基因IDI1-HlPT1L_Δ1-86整合到YS125的基因组后，得到的菌株YSC3的DMX产量提高至4 mg/L。

图4 代谢强化和酶融合提高DMX的生产

过氧化物酶体区室化合成DMX

前述研究证明了底物DMAPP的可利用性对于DMX生物合成过程中的异戊烯基化反应至关重要。考虑到过氧化物酶体中充足的乙酰辅酶A供应且不存在脂肪酸合成和FPP竞争，该研究将从对香豆酸到DMX的下游途径转移至过氧化物酶体，并重建过氧化物酶体中的DMAPP生物合成途径。使用了之前构建的高p-CA（131 mg/L）生产菌株RB14作为底盘菌株，并在此基础上过表达了ARO1、ARO2和ARO3以构建菌株RB99，进一步提高p-CA的产量。通过靶向表达内源ACC1(ACC1_per)和外源CHS_H1_per以及HlCCL1_per（得到菌株YS1per），NC/N的产量达到了28 mg/L。然而，后续通过表达IDI1_per、HlPT1L_Δ1-86per和HlCHIL2_per进行了过氧化物酶体中异戊烯基化途径的构建，得到的工程菌株YS2per未能产生DMX。

为了提供足够的前体DMAPP用于DMX的生产，作者在过氧化物酶体中重建了的MVA途径，然而，得到的工程菌株YS5per的DMX产量较低（6 μg/L）。进一步整合两个拷贝过氧化物酶体定位的HlPT1LΔ1-86_per、过表达CHS_H1_per和HlCHIL2_per后得到的菌株YS9per略微提高了DMX滴度。

在加强酰基化步骤后，该研究还尝试通过表达两个拷贝的ERG12_per来提高DMAPP供应，使得DMX的产量提高了100%。受此结果鼓励，该研究进一步尝试在过氧化物酶体中优化MVA途径：将ERG12_per、EfMVAE _per、EfMVAS _per和HlPT1L_Δ1-86per通过高拷贝质粒过表达，得到的菌株YS12per产生的DMX比菌株YS9per多2.7倍。此外，还尝试表达融合基因IDI1-HlPT1L_Δ1-86per(菌株YS15per)，与菌株YS9per相比，DMX产量提高了1.7倍。然而，DMX滴度仍然很低(<100 μg/L)，远低于胞质途径(菌株YSC3为4.0 mg/L)。作者推测可能是由于过氧化物酶体中PTase酶活性低和/或DMAPP可用性低。

图5 在过氧化物酶体中区室化合成DMX的工程优化

黄腐酚的生物合成

该研究最终尝试通过表达来自啤酒花（Humulus lupulus）的O-甲基转移酶基因HlOMT1，在含有胞质DMX生物合成途径的底盘菌株YSC3中生物合成黄腐酚。我们在底盘菌株YSC3中分别表达了HlOMT1的原始版本和用于在酿酒酵母中表达的密码子优化版本HlOMT1sc。结果菌株YSC6（HlOMT1）和YSC7（HlOMT1sc）分别生产了49 μg/L和142 μg/L的黄腐酚。

图6 黄腐酚的从头合成