1.引言
目前，立体定向体部放射治疗(SBRT)治疗颅外肿瘤被认为是一种标准的治疗方式，单次高剂量或少次数分割放射治疗。最初，这种类型的放射传递仅适用于使用立体定向放射外科(SRS)治疗颅脑肿瘤。最初，SRS被用于治疗动静脉畸形(AVMs)（这是一种由血管形成不良引起的大脑异常）。众所周知，脑动静脉畸形会导致动脉和静脉之间的主要功能障碍，通常需要医学治疗。研究表明，SRS可闭塞50%至90%的AVM，具体取决于其体积、位置和处方的辐射剂量。在SRS成功用于治疗AVM后，这项技术现在被用于治疗脑肿瘤和转移瘤。
影像引导和治疗计划放射治疗的最新进展使得SRS和SBRT分别更容易治疗颅骨和颅外肿瘤。一些临床前和临床研究使用这些技术治疗各种肿瘤的成功率很高。经典脱氧核糖核酸(DNA)损伤反应被认为是放射治疗中众所周知的效应之一。然而，人们已经认识到，高剂量的辐射还会启动一个信号级联反应，产生一种促凋亡的鞘脂，即神经酰胺。神经酰胺的生物合成始于内皮细胞膜外小叶上的酸性酸性鞘磷脂酶(ASMase)(酸性鞘磷脂酶(ASMase))对鞘磷脂的水解。神经酰胺分子在细胞膜上的聚集和聚集刺激内皮细胞凋亡。酸性鞘磷脂酶(ASMase)和/或神经酰胺抑制剂的加入阻止了这整个过程。这些现象在许多异种移植模型中都有报道，包括在野生型和酸性鞘磷脂酶(ASMase)敲除小鼠中移植的纤维肉瘤和黑色素瘤，现在已被确定为临床前反应的预测。神经酰胺内皮细胞凋亡的作用在临床研究中一直难以捉摸，很少有研究表明神经酰胺可以作为区分有反应和无反应患者的标志物。Satiskumar等人的一项研究证明，在接受单次高剂量15 Gy治疗的患者中，血清分泌酸性鞘磷脂酶(ASMase)(S-SMase)活性和神经酰胺水平的显著增加与良好的临床结果相关。相反，无反应的患者血清S-SMase和神经酰胺没有任何增加。同样，结直肠癌来源的肝和肺寡转移患者的血浆神经酰胺水平显著升高，随后导致肿瘤体积缩小。相反，无反应的患者表现出血浆神经酰胺下降和肿瘤体积增加。
SRS/SBRT的临床前和临床经验显示出显著的效果。然而，尚不完全清楚导致这些结果的生物学机制。大剂量放疗可破坏肿瘤血管系统，导致内皮细胞凋亡，导致额外的间接/继发性肿瘤细胞死亡。这种间接的肿瘤细胞死亡可以进一步增强抗癌免疫反应，这是由垂死的肿瘤细胞释放肿瘤抗原激活的。因此，由于SRS和SBRT后观察到的细胞杀伤和抗肿瘤作用增强，对标准放射生物学的理解已经发生了范式转变。
2.高辐射剂量后的放射生物学建模中的难题
1975年，Rodney Withers提出了决定分割放疗反应的四个因素，称为放射生物学的4R:修复(repair)、再增殖(repopulation)、再分布(redistribution)和再氧化(reoxygenation)。放射生物学的4R可以联系到传统分割放射治疗的成败。然而，当肿瘤接受高剂量SRS或SBRT治疗时，该模型就失效了。修复:在较高剂量下，由于修复机制饱和，亚致死DNA损伤的修复率降低。此外，短时间内较高的辐射剂量可导致DNA损伤增加，这可能导致更复杂的改变，使其难以修复。再增殖:SRS和SBRT治疗通常在一周内进行。在这么短的时间内，肿瘤细胞几乎不可能再生长。再分布:当细胞暴露于极高剂量(如20Gy)时，细胞周期进程被中断，导致细胞周期立即停止。这导致细胞在照射时所处的细胞周期阶段死亡。这与用低剂量处理细胞时不同，后者会导致细胞在G2/ M期优先死亡。再氧化:单次分割剂量放疗整体治疗时间短，每次剂量大于10 Gy /分割，会造成严重的血管损伤，使肿瘤内微环境缺氧水平升高，使缺氧细胞的再氧化过程停止。在常规分割放射治疗的每次分割中，肿瘤周围缺氧肿瘤细胞的死亡允许肿瘤更深的缺氧细胞再氧化，恢复放射敏感性，这与高剂量放射不同，高剂量放射会导致缺氧和缺氧细胞发生继发性细胞死亡。因此，放射生物学的4R一般在模拟对SRS和SBRT给予的高剂量辐射的反应方面是无效的。另一种放射生物学模型由Fowler于1989年提出，称为线性二次模型(linear-quadratic model, LQ model)，该模型估计肿瘤在不同辐射剂量下的生存预测。据报道，LQ模型可以准确地预测DNA损伤在常规分割剂量下引起的细胞死亡。然而，由于直接和间接细胞死亡的发生，该模型可能高估了高剂量下的细胞杀伤。基于LQ模型的肿瘤细胞存活曲线描绘了随着辐射剂量增加而出现的急剧弯曲，因为只有在剂量高于10 Gy时才会出现额外的肿瘤细胞死亡。LQ模型在很大程度上是基于体外数据生成的，其中纳入的剂量低于SRS/SBRT中使用的剂量，因此在每次分割高剂量时，其效用不合适[The LQ model is generated largely based on in vitro data that incorporates doses lower than what is used in SRS/SBRT making its utility inappropriate at high doses per fraction]。因此，虽然放射生物学的4R和LQ模型可以很容易地用于估计传统分割放射治疗的反应，但对使用这些原则来预测SRS和SBRT的结果仍然存在争议。
3.高剂量放疗的3个放射生物学决定因素
癌症的进展和转移依赖于肿瘤微环境的稳态，而肿瘤微环境由不同的细胞群组成。很明显，癌症治疗，包括化疗和放疗，不仅针对肿瘤，也针对其他细胞成分，如血管内皮细胞和免疫细胞。对内皮细胞对肿瘤反应的贡献的兴趣激增始于1971年，当时Judah Folkman首次认识到肿瘤的生长和存活依赖于血管生成。血管生成的过程依赖于内皮细胞的增殖、迁移和重塑[ The process of angiogenesis relies on the proliferation, migration, and remodeling of endothelial cells]。众所周知，内皮细胞是辐射诱导细胞死亡的主要目标，因为它们分泌的酸性鞘磷脂酶(ASMase)丰富(是其他细胞的20倍)。酸性鞘磷脂酶(ASMase)诱导的增加神经酰胺生成是实现内皮细胞凋亡效应的必要条件。
Garcia-Barros等的研究表明，内皮细胞凋亡是主要事件，其次是继发性肿瘤细胞死亡，这有助于整体辐射诱导的肿瘤反应。用酸性鞘磷脂酶(ASMase)和Bcl -2相关X蛋白(Bax)缺乏的小鼠进行实验，植入MCA/129纤维肉瘤和B16F1黑色素瘤，与野生型相比，肿瘤生长增强了200%至400%。野生型(酸性鞘磷脂酶(ASMase)+/+)小鼠在15-20 Gy剂量后1至6小时内内皮细胞死亡显著增加，而同一小鼠的肿瘤细胞在2至3天内保持完整。肿瘤细胞死亡数天后发生，随后导致肿瘤生长延迟延长，肿瘤总治愈率提高50%。调节内皮细胞凋亡的机制有助于整体肿瘤反应，已知依赖于酸性鞘磷脂酶(ASMase) -神经酰胺途径的激活。在照射的几个小时内，神经酰胺在内皮腔室的积累导致其迅速破坏，随后是肿瘤细胞的雪崩死亡。Santana等的一项研究报道，来自酸性鞘磷脂酶(ASMase)缺陷的Niemann-Pick患者的淋巴母细胞消除了辐射诱导的神经酰胺形成和凋亡过程。人酸性鞘磷脂酶(ASMase) cDNA的逆转录病毒转移通过诱导神经酰胺依赖性细胞凋亡逆转了这一现象。此外，将携带纤维肉瘤的野生型(酸性鞘磷脂酶(ASMase)+/+)小鼠暴露在单次剂量20 Gy下，肺和胸腺组织中出现了显著的凋亡细胞死亡。在(酸性鞘磷脂酶(ASMase)−/−)小鼠中，相同的辐射剂量未能诱导内皮细胞神经酰胺的产生和凋亡。Pena及其同事得出了类似的结论，在5至100 Gy的剂量照射C57BL/6小鼠中枢神经系统(CNS)后，内皮细胞凋亡呈剂量和时间依赖性。研究发现，在CNS标本中，内皮细胞死亡占辐射诱导的凋亡的20%，在照射后4 -24小时的窗口内，内皮细胞死亡在12小时达到峰值。静脉注射成纤维细胞生长因子(FGF)和碱性内皮生长因子(bFGF)，在给药50 Gy前后均可抑制内皮细胞凋亡。因此，这些研究表明，高剂量后发生的内皮细胞死亡是酸性鞘磷脂酶(ASMase) -神经酰胺途径介导的整体肿瘤反应的主要原因。一些研究反驳了这些发现，并强调肿瘤细胞是增强辐射反应的原因。
为了确定肿瘤细胞在辐射应答中的作用，将DNA双链断裂修复基因DNA依赖性蛋白激酶(DNAPKcs - / -)缺失的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠插入功能性(DNA- pkcs +/+)基因。暴露于单次剂量30 Gy或4× 5 Gy的分割超过2天，与(DNA-PKcs+/+)对照物相比，(DNAPKcs−/−)小鼠的肿瘤生长延迟了1.5倍。因此，将功能性DNA修复基因接种到肿瘤细胞中，恢复了肿瘤细胞的辐射抗性，从而降低了肿瘤细胞的辐射应答。此外，Moding及其同事采用双重组酶技术，在内皮细胞和肿瘤细胞都有靶向突变的基因工程小鼠模型中产生原发性肉瘤。研究表明，从小鼠内皮细胞和肿瘤细胞中去除促凋亡基因Bax和DNA损伤反应基因ataxia毛细血管扩张突变(Atm)的原发性肉瘤表现出不同的结果。从小鼠内皮细胞中去除Bax和Atm基因并不影响原发性肉瘤对20 Gy放射治疗的反应。相反，从小鼠肿瘤细胞中去除的相同基因导致肿瘤细胞死亡和原发性肉瘤生长抑制显著增加。因此，研究表明肿瘤细胞，而不是内皮细胞，是辐射反应的主要决定因素。Ogawa等的一项有趣观察表明，裸鼠的肿瘤细胞是决定辐射反应的关键，而在SCID小鼠中，肿瘤细胞和内皮细胞的损伤共同决定放射敏感性。
在关于内皮细胞是否决定肿瘤对放射治疗的反应这一有争议的争论之后，Garcia-Barros等对SCID小鼠进行了实验，这是一种已知的DNA修复基因携带种系突变的模型。与其他小鼠模型相比，这些小鼠的辐射敏感性也高出2.5至3.0倍。为了证实内皮成分参与辐射反应，我们将SCID (酸性鞘磷脂酶(ASMase)+/+)和C57BL/6 (酸性鞘磷脂酶(ASMase)+/+)小鼠生长的MCA/129纤维肉瘤和B16黑素瘤暴露于高剂量放疗中。单次剂量20 Gy可导致SCID (酸性鞘磷脂酶(ASMase)+/+)和C57BL/6 (酸性鞘磷脂酶(ASMase)+/+)小鼠内皮细胞明显死亡。在SCID (酸性鞘磷脂酶(ASMase)+/+)小鼠中，肿瘤生长延迟的模式与野生型C57BL/6 (酸性鞘磷脂酶(ASMase)+/+)小鼠相似。在(酸性鞘磷脂酶(ASMase) - / -)小鼠植入的肿瘤中，内皮细胞凋亡和肿瘤生长被抑制。因此，该研究得出结论，内皮细胞层是增强辐射反应的唯一原因，肿瘤细胞不影响辐射诱导的内皮细胞凋亡和整体辐射反应[the study concluded that the endothelial compartment is solely responsible for enhanced radiation response and that the tumor cells do not impact the radiation-induced endothelial cell apoptosis and overall radiation response]。
4.细胞对高剂量放射治疗的反应
4.1高剂量辐射引起的直接和间接细胞死亡
多年来，人们认为电离辐射诱导的细胞死亡主要依赖于DNA损伤。然而，当一种替代机制被证明单次高剂量放疗诱导质膜改变可导致鞘磷脂途径激活，随后神经酰胺生成时，这种信念被改变。神经酰胺一旦形成，就可以作为第二信使，触发各种凋亡信号通路。HaimovitzFriedman等利用牛主动脉内皮细胞(BAEC)证实神经酰胺参与了细胞凋亡反应。在全细胞裂解物和由BAEC制备的无核膜中，神经酰胺水平在辐射暴露(单剂量10 Gy)几分钟内达到最大值。因此，本研究证实了辐射诱导的细胞凋亡可以独立于DNA损伤。现在很明显，辐射诱导细胞死亡的途径不止一种(图1)。一般情况下，低剂量的辐射会对DNA产生细胞毒性作用，导致DNA双链断裂，从而直接导致肿瘤细胞死亡。另一方面，高剂量辐射可以直接杀死肿瘤细胞，通过DNA损伤，或通过p53依赖的方式间接杀死肿瘤细胞，或通过内皮细胞损伤导致肿瘤血管大量塌陷。高剂量诱导的血管功能障碍可通过引起肿瘤缺氧和免疫反应进一步引起肿瘤细胞死亡。Garcia-Barros及其同事首次报道了高剂量放疗后血管内皮损伤导致肿瘤细胞死亡的发生。结果表明，酸性鞘磷脂酶(ASMase)缺陷小鼠内皮细胞凋亡减少，而野生型小鼠内皮细胞和肿瘤细胞明显死亡。这证实酸性鞘磷脂酶(ASMase) -神经酰胺激活对于辐射诱导的血管内皮损伤至关重要。其他几项研究也报道了神经酰胺诱导的内皮细胞凋亡参与调节整体肿瘤反应。Czarnota等的大量研究表明，在给予8 Gy的辐射剂量之前，用超声刺激微泡(USMB)进行预处理可导致神经酰胺显著升高，导致大量血管内皮细胞死亡。El Kaffas等使用MCA/129携带纤维肉瘤的野生型(酸性鞘磷脂酶(ASMase)+/+)小鼠、敲除型(酸性鞘磷脂酶(ASMase)−/−)小鼠和神经酰胺拮抗剂鞘氨醇-1-磷酸(S1P)治疗的野生型小鼠，研究了辐射联合USMB的剂量依赖性效应。在(酸性鞘磷脂酶(ASMase)+/+)小鼠中，与仅辐射(8 Gy)相比，USMB和8 Gy的组合在3小时、24小时和72小时导致的细胞死亡率最高，分别为8.7%、53.2%和37.8%，在3小时、24小时和72小时分别导致10.0%、17.3%和15.4%的细胞死亡率。此外，USMB联合放射治疗可使肿瘤血流在24小时内衰减40%，并持续到72小时。据报道，血管在24小时内关闭是内皮细胞死亡的原因。该研究进一步表明，(酸性鞘磷脂酶(ASMase)+/+)小鼠的神经酰胺水平在给予USMB和8 Gy放射治疗的24小时内升高，这证实了内皮酸性鞘磷脂酶(ASMase) -神经酰胺激活参与导致整体肿瘤血管破坏。
图1内皮细胞和肿瘤细胞对低、高剂量放疗的反应。
许多其他研究也表明，肿瘤灌注减少伴随内皮细胞死亡。放疗(12 Gy)后对异种神经母细胞瘤进行照射，使肿瘤血容量减少63%，导致内皮细胞损伤。同样，接受单剂量20 Gy照射的正位人脑瘤大鼠表现出明显的细胞凋亡，肿瘤血流量在照射后2小时内减少80%，表明血管的变化与内皮损伤相对应。
Song及其同事先前对小鼠FSaII纤维肉瘤肿瘤进行的研究表明，单次剂量20 Gy后1至5天内，血液灌注严重下降，并伴有缺氧升高。本研究报道的继发性肿瘤细胞延迟死亡是肿瘤血管广泛闭塞和瘤内缺氧增加的结果。辐射引起的血管损伤也可引起缺氧细胞死亡。在暴露于高剂量时，一部分在直接和间接细胞死亡中幸存下来的缺氧细胞后来变得缺乏营养，最终导致死亡。此外，由于大量辐射诱导的肿瘤细胞死亡导致的营养和氧气减少，血管出现无功能可能导致缺氧细胞死亡。据报道，患有FSaII纤维肉瘤的小鼠暴露于20-30 Gy的单剂量下，细胞存活率降低3-4 log，而高达90 Gy的剂量对细胞存活率降低8 log至关重要。辐照后发生的进行性细胞存活丧失是由营养被剥夺所引起的。Hill及其同事在小鼠KHT肉瘤模型中也报告了类似的观察结果。单次剂量20Gy的肿瘤照射导致缺氧细胞死亡的倍数为3- 4倍。这些数据证实，除了高剂量放疗后血管损伤导致的肿瘤细胞死亡外，还存在缺氧细胞死亡。
除了直接和间接的细胞死亡效应外，已知SRS和SBRT可引发抗肿瘤免疫反应。辐射诱导的肿瘤细胞死亡引发肿瘤抗原的释放，引起免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death, ICD)。垂死的受辐照肿瘤细胞释放高迁移率组盒1 (HMGB1)蛋白，该蛋白相互作用并激活树突状细胞上的toll样受体(TLR)-4，诱导抗肿瘤反应。最近，一个基于小鼠乳腺实验数据的数学框架表明，诱导抗肿瘤免疫需要每次分割10 - 13 Gy的辐射剂量。综上所述，这些研究表明，与传统的分割放疗相比，SRS和SBRT可能杀死更多的癌细胞。DNA损伤引起的直接细胞死亡和血管功能障碍介导的间接继发性肿瘤细胞死亡占细胞死亡的大部分。此外，由于肿瘤内微环境恶化导致的大量缺氧细胞死亡(假设实体瘤中20%的肿瘤细胞是缺氧的)，加上抗肿瘤免疫反应增强导致的肿瘤细胞死亡，进一步导致了SRS和SBRT后的细胞死亡。
4.2辐射引起的血管改变
在过去的几年里，我们对肿瘤脉管系统的理解不断发展。正常的血管系统是由均匀分布的动、静脉和毛细血管分层排列的，而肿瘤的血管系统是高度无序、不规则、混乱、扩张、渗漏和弯曲的，无法区分动脉和小静脉。正常血管的内皮层是有规则形状的，由有组织的周细胞作为基底膜完全支撑。相反，肿瘤血管的结构由内层内皮细胞构成，内皮细胞连接不良，异常周细胞的支持不均匀。由于这些形态异常，肿瘤血管极易受到电离辐射的影响。几项研究报告了大剂量放射治疗后血管的剧烈变化。随着结构完整性的改变，肿瘤血流和肿瘤氧合的波动可能是辐射剂量高于8至10 Gy后报告的最显著的变化。Park等已经详细回顾了多种肿瘤类型中辐射诱导的血管变化。来自人体研究的集体数据表明，在分割放疗开始时观察到肿瘤血流量有轻微增加的总体趋势，或者在某些情况下血流量没有变化，随后在治疗过程结束时减少。在临床前动物模型中，暴露于1.5 - 2.0 Gy剂量的常规分割放射治疗中，在放射早期血管没有变化，在放射后期有轻微的血管功能障碍的报道。然而，5 - 10 Gy的单次剂量会引起中度血管损伤，而将剂量增加到10 Gy/分割以上会导致肿瘤血管严重恶化。
众所周知，辐射诱导的肿瘤血管效应广泛依赖于辐射剂量、剂量之间的持续时间、肿瘤类型、分期和肿瘤部位。Song和他的同事们之前已经报道了大量的工作，他们使用在大鼠后腿生长的Walker 256癌来研究辐照肿瘤的血管变化。暴露于2、5、10、30和60 Gy单剂量下的肿瘤在照射后数天进行监测(测量血管内体积和血浆蛋白外渗率/血管通透性)。2Gy和5Gy的辐射剂量没有引起血管反应。然而，10Gy、30Gy或60 Gy的单次剂量在照射第2天、第6天和第12天后导致血管体积明显消除（abolishment of vascular volume ）。其他几项研究也报告了高剂量给量后肿瘤血流量减少。他们认为，大于10Gy的单次剂量比分割照射的相同剂量对血管损伤的影响更大[ They suggest that a dose higher than 10 Gy in a single fraction is more effective in causing vascular damage than the same dose given in fractions]。用分割剂量治疗的肿瘤，随着分割次数的增加，血管体积开始短暂增加，随后迅速下降（Tumors treated with a fractionated dose initiate a transient increase followed by a rapid fall in vascular volume as the number of fractions increases.）。这与单次高剂量导致整个肿瘤血管体积急剧下降的结果相反（ This is contrary to what is observed with a single high dose which results in a sharp decline in vascular volume throughout the tumor. ）。
众所周知，辐射引起的血管改变会极大地影响肿瘤氧合，但关于血管损伤是否导致氧张力变化的报道存在矛盾。横纹肌肉瘤大鼠在4周内接受20次60 Gy的分割放疗后，肿瘤氧合监测显示，直到第3周，氧分压(pO2)测量值没有显著变化。然而，在第4周，有报道称肿瘤pO2明显下降，这可能是由于肿瘤毛细血管阻塞所致。另一方面，将a -07人类黑色素瘤异种移植物暴露在单剂量10 Gy的情况下，导致72小时内血液灌注下降40%，细胞外体积分数增加25%。在这种情况下，肿瘤pO2含量保持不变，表明血管变化与氧合没有相关性。肿瘤血管灌注和氧合的异质性经常被报道。在许多类型的肿瘤中都观察到肿瘤中心的血容量比边缘的血容量少的现象。晚期非小细胞肺癌患者按2、4和6次分割给予27 Gy剂量，导致肿瘤边缘血管血容量分别增加31.6%、49.3%和44.6%。在放疗相同分割次数下肿瘤中心血容量分别维持16.4%、19.9%和4.0%[The blood volume in the tumor center remained 16.4%, 19.9%, and 4.0% with the same fractions of radiotherapy]。Mottram 的一项重要观察表明，与肿瘤中心的细胞相比，周围的肿瘤细胞对放射更敏感。位于外周的细胞更靠近附近的血管，因此有充足的氧气供应。1955年，Thomlinson和Gray对支气管癌进行了详细的定量检查，以研究肿瘤边缘细胞和中心细胞的放射敏感性。他们发现，靠近毛细血管的细胞获得了足够的营养/氧气并保持了增殖能力，而距离毛细血管超过100µm的细胞仍然没有活力。在辐照期间，中心区域较低的氧含量使细胞比周围充氧良好的细胞更具抗辐射能力。
5.放疗与抗血管生成策略相结合
在大多数实体瘤中，脉管系统仍然高度不均匀。肿瘤血管生成通过提供必需的营养和氧气来维持肿瘤的生存。多种血管生成调节因子的平衡是肿瘤生长和转移所必需的。针对肿瘤血管系统治疗实体瘤已经显示出非凡的成功，在过去几年中。目前，各种血管靶向药物，如抗血管生成药物和血管破坏药物，正在临床前和临床研究中被广泛研究。目前正在进行几项使用血管生成抑制剂治疗人类癌症的临床试验。部分获批临床试验的药物列于表1。已知抗血管生成药物抑制并在某些情况下完全停止新血管的生长，而血管破坏剂被设计为选择性地减少或关闭肿瘤血液流动。
表1正在进行治疗人类癌症临床试验的血管生成抑制剂/药物。
肿瘤通过分泌多种血管生成生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast growth factor，bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)，促进新生血管的生长。血管内皮细胞表达多种受体，血管生成生长因子与这些受体结合并启动各种信号通路。血管生成抑制剂/药物的使用阻断了新血管的形成，通过减轻酸性鞘磷脂酶(ASMase)产生的神经酰胺来阻止肿瘤的生长和进展。Truman等的研究表明，辐射诱导的神经酰胺可作为内皮细胞存活和死亡的变阻器，抗血管生成治疗的时机对于致敏肿瘤至关重要。研究表明，bFGF和VEGF抑制辐射诱导的酸性鞘磷脂酶(ASMase) -神经酰胺激活，并通过添加内源性C16神经酰胺逆转MCA/129纤维肉瘤的凋亡。在放射治疗13.5 Gy前1小时用血管生成抑制剂DC101治疗肿瘤，可导致酸性鞘磷脂酶(ASMase)生成的神经酰胺增强，随后引起内皮细胞凋亡。然而，放疗后1小时注射DC101仍然无效。Rao等也报道了类似的观察结果，表明在放射治疗前1小时给予VEGF抑制剂阿西替尼（axitinib）可增加肿瘤的放射敏感性。单次暴露剂量27 - 40 Gy与阿西替尼联合可导致体外原代培养细胞和体内MCA/129肉瘤或B16F1黑色素瘤小鼠内皮细胞死亡。在放疗和阿西替尼联合治疗后，这些小鼠的肿瘤生长延迟，完全缓解率提高了40%。在一些研究中也报道了血管生成抑制剂/药物和放疗联合治疗后的肿瘤反应;然而，血管生成抑制剂与放疗之间相互作用的确切机制尚不清楚。抗血管生成/血管靶向药物联合放疗有望通过减少肿瘤血液灌注和氧合来增强肿瘤反应。然而，研究表明，两者结合后，肿瘤血流量和氧浓度增加。乳腺(MDA-MB-231)异种移植物，当暴露于单剂量的8和16 Gy联合舒尼替尼（sunitinib）(一种VEGF抑制剂)时，显示出显著的细胞死亡，随后肿瘤血流量增加50%。据认为，单次高剂量辐射可对异常血管造成损害，而添加舒尼替尼可使血管正常化，从而增加氧合。
图2 异种移植PC3肿瘤内皮细胞ISEL组化染色和功率多普勒超声图像显示移植PC3肿瘤24小时对治疗的反应。
近年来，USMB治疗已被证明是一种新的靶向抗血管生成治疗形式。微泡是一种体积在1 - 4µm之间的充满气体的小气泡，由于其优异的声响应而被广泛用作超声造影剂。当与超声波接触时，微泡可以振荡、膨胀和崩溃，从而导致周围组织环境的整体变化。超声声压下气泡破裂可导致严重的血管破裂，增强肿瘤反应。Czarnota及其同事的大量研究表明，放疗和USMB联合使用可导致内皮细胞明显死亡，随后微血管恶化。一项对前列腺肿瘤异种移植(PC3)进行的研究显示，2 Gy或8 Gy放射剂量联合低剂量或高剂量USMB治疗的细胞死亡率为44±13%(平均±标准误差)，8 Gy + USMB治疗的细胞死亡率为70±8%。功率多普勒超声检测血管破裂显示，单独放疗可使肿瘤血流量减少18±22%(平均±标准误差)，单独放疗可使肿瘤血流量减少20±37%，8 Gy和USMB联合治疗可使肿瘤血流量减少65±8%(图2)。此外，联合治疗组肿瘤生长明显延迟，增殖细胞减少。来自其他患有乳腺、膀胱和纤维肉瘤肿瘤的小鼠模型的数据也显示了使用这些联合疗法的类似效果。用辐射和USMB联合观察到的内皮细胞死亡诱导的血管功能障碍是神经酰胺依赖的。已知USMB引起内皮细胞膜的机械扰动，导致神经酰胺生成增强，随后血管破坏。Kim等人的一项研究报道，在使用USMB和辐射(8 Gy)联合治疗后，PC3异种移植物的神经酰胺含量增加了14倍。神经酰胺水平升高与肿瘤细胞死亡和血管损伤增加有关。随后，Al-Mahrouki及其同事广泛研究了USMB和放射治疗后神经酰胺介导的肿瘤血管破坏调控的遗传途径。他们特别研究了UDP糖基转移酶8 (UGT8)在肿瘤反应增强中的作用。UGT8是催化半乳糖转化为神经酰胺的关键酶。实验用基因修饰的PC3细胞和稳定转染UGT8基因下调的PC3细胞产生的肿瘤异种移植物进行。在下调的UGT8肿瘤模型中，与对照肿瘤相比，USMB和8Gy剂量的组合引起更大的细胞损伤。此外，他们还报道了UGT8下调模型中肿瘤血流量和氧饱和度水平的显著降低。研究发现，由于UGT8基因的下调，肿瘤反应的增加伴随着神经酰胺的大量积累(图3)。因此，靶向UGT8联合血管破坏治疗可能是进一步探索和优化这一新的癌症治疗策略的一个很好的起点。
图3 UGT8信号传导及其在神经酰胺生物合成中的作用模型。
6结论
SRS/SBRT越来越被认为是治疗癌症的基本选择之一。单个或少量剂量的高剂量辐射通过引起神经酰胺介导的内皮细胞凋亡导致间接/继发性肿瘤细胞死亡来影响肿瘤血管系统。间接的肿瘤细胞死亡进一步引起免疫反应，导致辐射反应的整体增强。通过激活酸性鞘磷脂酶(ASMase)途径产生的神经酰胺是辐射诱导的血管内皮细胞损伤的中心决定因素。通过使用各种血管生成抑制剂和/或抗血管生成疗法(USMB)上调酸性鞘磷脂酶(ASMase)释放的神经酰胺，可以恢复肿瘤的放射敏感性。内皮细胞和肿瘤细胞的损伤似乎是由低剂量(1.8 - 3Gy)和单次高剂量(>8Gy)单独或联合USMB (2 - 8Gy + USMB)引起的。(A)对于每次低剂量分割，缺氧介导的ROS导致HIF-1翻译，使细胞具有放射抗性。抑制HIF-1可导致大量内皮细胞死亡、微血管损伤和肿瘤细胞死亡增加。(B)高剂量诱导的肿瘤细胞死亡是通过溶酶体酸性鞘磷脂酶(ASMase)快速易位到内皮细胞膜的细胞外小叶导致神经酰胺生成介导的。神经酰胺在内皮细胞内的积累导致内皮细胞破坏，进而导致血管塌陷和肿瘤细胞死亡。S1P、VEGF和bFGF的加入可以阻止这整个过程。缩写:ASMase，酸性鞘磷脂酶;bFGF，碱性成纤维细胞生长因子;DNA,脱氧核糖核酸;HIF-1，缺氧诱导因子1;ROS，反应性氧化物;S1P，鞘氨醇-1-磷酸;USMB:超声刺激微泡;VEGF，血管内皮生长因子。
(A)经ISEL染色证实，USMB和辐射(8Gy剂量)联合治疗的肿瘤显示细胞死亡增加。ISEL 阳性细胞可以通过深色染色的细胞核来识别。比例尺代表60微米。(B)与不进行治疗或仅进行USMB和放疗的对照组相比，USMB和放疗联合治疗后血流信号明显下降。比例尺代表2mm。ISEL=原位末端标记;MB =微泡;NIL=无微泡;XRT =辐射。
神经酰胺的新生生物合成发生在内质网。升高的UGT8表达可将神经酰胺转化为半乳糖神经酰胺，导致神经酰胺降解并抑制凋亡信号通路。相反，当UGT8表达不足时，会导致神经酰胺水平升高，启动细胞死亡信号通路[96]。内质网;GalCer，半乳糖基神经酰胺;MB + US，微泡+超声;S1P 鞘氨醇-1-磷酸;Ser、丝氨酸;SM,鞘磷脂;SMPD1，鞘磷脂磷酸二酯酶1;鞘磷脂磷酸二酯酶2;UGT8,UDP糖基转移酶8
