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内容来源于Angewandte Chemie International Edition
三糖修饰(包括直链和支链)是三萜类化合物中重要的糖基化类型，对提⾼其水溶性及药理活性具有重要意义。然而极高的区域选择性，限制了UGT催化三萜类化合物的双糖链的延长，据报道，只有少数 UDP-葡萄糖基转移酶在C3-OH下合成稀有的具有直链三糖的三萜类化合物，因此需要有效的UGT酶开发策略，挖掘更加稳健的UGT来合成具有线性三糖的多样化三萜皂苷。清华大学李春教授团队长期从事生物催化与酶工程的研究，于2024年8月22日在Angewandte Chemie International Edition发表了题为Engineering the Substrate Specificity of UDP-Glycosyltransferases for Synthesizing Triterpenoid Glycosides with a Linear Trisaccharide as Aided by Ancestral Sequence Reconstruction的研究文章，利用祖先序列重建技术改造UDP‑糖基转移酶的底物特异性，用于合成具有线性三糖的三萜糖苷。![]()
该研究首先通过7个UGT91H亚家族糖基转移酶酶对30种结构多样的三萜底物的糖基转移酶活性，鉴定出UGT91Hs专一性地催化 C3 位羟基上含二糖链的三萜底物的2"-O-糖基化反应，且表现出相当严格的底物特异性，这阻碍了它们在更⼴泛的三萜底物糖基化中的应用。为了进一步拓展 UGT91Hs 的底物适用范围,研究通过祖先序列重建(ancestral sequence reconstruction，ASR)技术，获取 UGT91H 亚家族的祖先酶，其中最古⽼的酶UGT91H_A1，全面涵盖了 UGT91H 亚家族序列的特征，与现存的UGT91H酶相比，UGT91H_A1 对底物转化率更高且显⽰出更⼴泛的糖基供体底物范围。
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祖先重构酶 UGT91H_A1 与现存的 UGT91H 酶具有相对较⾼的序列相似性（66.03%‑84.23%），为了探究UGT91H酶序列‑结构‑功能关系，研究比较了UGT91H_A1与同源性最高的UGT91H8的底物特异性差异，以祖先酶UGT91H_A1为模型，通过定点突变实验鉴定了影响底物特异性的关键序列片段RTAS loop(R212/T213/A214/S215) ，分子动力学模拟和量子力学计算进一步揭示,RTAS 可影响酶-底物结合能和相互作用模式,从而调控 UGT91Hs 的底物特异性。
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随后，本研究将UGT91H_A1与自循环再生UDP-鼠李糖的四酶级联系统偶联，成功实现了具有线性三糖的三萜皂苷2a和17a 的高效制备。此外，研究基于已鉴定的 UGT91H 酶, 开发了一个基于系统发育平台高效挖掘UGT91H酶的新策略，利用序列比对和进化分析,从8种豆科植物的基因组数据库中挖掘出19个UGT91H酶。
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综上，本研究表明UGT91H亚家族催化三萜的2"-O-糖基化，具有高度的区域选择性，通过祖先序列重建(ASR)技术成功优化了UGT91H 酶的底物适用范围和催化活性。 RTAS loop被鉴定为影响UGT91H_A1的底物特异性的关键序列片段，通过分子动力学模拟和量子力学计算阐明了 RTAS 调控 UGT91H 酶底物选择性的分子机制。将UGT91H_A1与UDP-鼠李糖再生系统相结合，低成本合成了具有线性三糖的萜类鼠李糖苷，开发了基于系统发育平台从植物基因组数据中高效挖掘UGT91H的新策略。本研究证明了ASR是设计UDP-糖基转移酶功能的有效工具，为合成具有线性三糖的各种三萜糖苷提供了强大的生物催化剂，并为实现更多三萜皂苷的酶促合成奠定基础
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