微流控在mRNA的应用

微流控是一种精确控制和操控微尺度流体，尤其特指亚微米结构的技术，又称其为芯片实验室(Lab-on-a-Chip)或微流控芯片技术。其是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。由于在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。由于微米级的结构，流体在微流控芯片中显示和产生了与宏观尺度不同的特殊性能，因此发展出独特的分析产生的性能。同时还有着体积轻巧、使用样品及试剂量少、能耗低，且反应速度快、可大量平行处理及可即用即弃等优点。

从1995年首家微流控技术公司诞生开始，微流控芯片正式开启了商业化、产业化之路，芯片的快速模板复制法PDMS、芯片的软光刻微阀/微泵被相继提出，首台微流控芯片商品化仪器在1999年被安捷伦公司和Galiper公司联合推出，被应用于生物分析和临床分析领域。在国外已经发展了十年的微流控技术，直到了二十一世纪初才正式进入中国，伴随着体外诊断（IVD）产业在中国的逐步兴起，微流控在近几年才逐步被人熟知。

微流控的制作材料上讲，半导体材料硅材料是制备微流控芯片的首选材料，但由于微流控芯片应用场景的不断拓展，硅材质不能耐受高压，且不能兼容光学检测技术，故被抛弃。随之迎来的是玻璃材质的微流控芯片。玻璃材质能够达到良好的电渗性质和光学性质，理论上是完美的微流控芯片制作材料，但是玻璃材质不易于光刻和蚀刻，制作工艺复杂费时，且成本昂贵，导致其不能大规模推广。对比之下，高分子材料体现出了优势，高分子聚合物加工简单、原材料便宜，且具有良好的绝缘性、耐高压性、热稳定性、生物兼容性、气体通透性、弹性模量低等特点，能广泛应用于毛细管电泳微芯片、生化反应芯片、多种光学检测系统中。以聚二甲基硅氧烷（PDMS）为代表的有机高分子聚合物成为了目前微流控芯片制作的热门材料。

微流控器件可以高度重复和高通量的方式制备纳米颗粒。微流控芯片可以操控微米尺度通道中的流体，被广泛应用于纳米技术领域。微流控芯片中的微反应器通常是管状结构，内部尺寸通常小于一毫米，纳米颗粒的合成在微反应器中进行。微流控芯片通常用高分子聚合物，如PDMS或玻璃制成。多篇发表文献已经表明，使用微流控装置可大幅度提高反应得率，并改善粒径和形状分布。

有效的体内递送是mRNA疫苗（药物）实现治疗效果的关键性要素。外源mRNA必须穿透脂质膜的屏障，才能进入细胞质，进而被成功翻译成功能性蛋白质。将mRNA递送到细胞内部共有两道障碍，递送途中的酶降解和静电排斥致使的膜屏障。理想的递送系统需要满足以下几个条件：在到达靶点之前要有效地包裹和保护mRNA以维持其稳定；帮助 mRNA 高效地进入细胞；在 mRNA到达溶酶体之前及时地将其释放到细胞质中。脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticles，LNPs)载体成了mRNA疫苗最常用的载体之一。LNP主要由可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂（PEG-脂质）组成。阳离子脂质是在酸性pH条件下，可离子化成带有正电荷脂质，因此能够在酸性缓冲液中将它和mRNA组成复合物，但是在生理条件pH条件下，它呈现中性，从而能够减少毒性。PEG脂质的疏水端与阳离子脂质的疏水端结合，其PEG亲水端则在水溶液里形成纳米颗粒的最外层，其比例决定了纳米颗粒的大小。胆固醇是为了增加核酸脂质纳米粒的稳定性，使PEG-脂质的疏水端与阳离子脂质的疏水端结合更为紧密。而中性辅助磷脂能够促进LNP和细胞膜以及内吞体膜的结合，促进细胞摄取和内吞体逃逸。临床应用的脂质体药物载体通常要求尺寸在20 ~ 200 nm 左右，尺寸均一，这种单分散脂质体药物载体可以明显提高药物的生物利用度，避免免疫细胞的清除，减小毒副作用，提高治疗的靶向性。因此制备尺寸均一、大小可控、质量可控的脂质体药物载体对研究药物输送、缓释有着重要的意义。

目前mRNA和脂质的混合是通过微流控系统来完成的，微流控过程工艺参数需要考虑总流速、压力、流速比例、芯片内部结构、温度等条件。将核酸与脂质分别溶解在水相和有机相后，纳米药物制备系统推动两相溶液通过特制芯片通道，完成纳米颗粒的合成；微流控脂质体制备技术不仅能很好地控制脂质体的尺寸均一性，而且脂质体尺寸大小、药物包封量等都可以通过改变各相流体的流动参数实现精确调控，具有显著优势。

流体聚焦法，主要是指连续流制备脂质体。在芯片中间通道引入含二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）和胆固醇的异丙醇溶液作为有机相，两侧通道引入PBS溶液，当三股流体在主通道聚焦时，脂-醇溶液被两侧水相挤压并扩散至水相形成窄的混合溶剂区。当混合溶剂区醇含量低于脂溶解所需的醇含量，磷脂会自组装形成单层小尺寸球形脂质体。脂质体的大小可通过有机相或水相流体流速调控在100-300 nm，单分散性好。为了更好地控制流体特性和所制备脂质体的尺寸，也可以采用一种五个进口、三个出口的微流控结构，水溶性物质直接被两侧的醇相包封，随后形成包封水溶性物质的脂质体，很大程度上减少了包封物质的浪费。

醇相与水相总流速( TFR) 与流速比（水相/醇相=FRR) 对脂质体制备的具有决定性的影响。当TFR比较小时，改变TFR但保持固定的FRR，对脂质体大小和尺寸分布影响不大；当增大FRR时，脂质体的粒径随之减小。使用流体聚焦微流控芯片，并使用不同链长的磷脂酰胆碱( PC)、胆固醇和双十六烷基磷酸( DCP) 作为制备脂质体的组分，当FRR一定时，TFR的增加会导致脂质体的增大，而且FRR数值越小，脂质体增大越明显。研究表明微流控芯片通道尺寸、深度以及几何形状对制备的脂质体性能没有显著影响，不同的芯片结构、通道尺寸以及流体聚焦模式都可以产生尺寸相似的脂质体。但通道尺寸和深度较大的芯片易于制作和操控，且制备通量更高，有利于实际应用。

通过对三进口流体聚焦型、Y型以及微混合器型等三种不同结构的芯片并从微流体通道尺寸、进口通道之间角度、芯片材料、制备方法等方面的研究发现，脂组分浓度、乙醇含量、脂组成、FR 变化等对制备的脂质体都有很大的影响。脂组分浓度的增加导致制备的脂质体粒径明显增大，而乙醇含量的影响正好相反。中性脂组分制备的脂质体粒径明显大于带正电的脂组分制备的脂质体。增大FR使脂质体的粒径变小。

温度对脂质体尺寸影响极为显著，较高温度制备的脂质体尺寸明显小于室温制备的脂质体。在醇-脂体系中，温度对脂质体的制备影响较大。

虽然二维流体聚焦对制备脂质体的分散性和尺寸大小能极好地控制，但是作为商业化手段来实现脂质体的制备仍然面临制备通量低的问题。基于此，研究者开发了三维同轴聚焦技术。

水-油-水( W / O / W) 双层微乳液滴法已经作为一种高效、方便的技术用于制备单分散的GUV。通常，油相为挥发性的有机溶剂，促使单层脂分布在水-油界面形成双层脂膜，排列成双层微乳，通过溶剂萃取，W / O / W 双层微乳形成脂质体( 如图3b)。Siddharth Deshpande等使用微流控平台产生双层微乳，并自发组装成GUV。 他们使用局部改性的PDMS微流控芯片制备出单分散性和稳定性俱佳的 W / O / W 双层微乳液滴。通过各相流体流量可以方便地控制双层微乳液滴的尺寸，从而得到尺寸均一、分散稳定的双层微乳液滴，进一步得到单分散的巨型脂质体。

微流控液滴法能避免诸如包封率低、非生理性环境和多分散性等难题。微流控液滴具有更大的比表面积，相比较连续流流体聚焦能够更好地控制形成的脂质体的大小和均一性，而且有很高的包封率。但是以微乳为基础的微流控液滴制备方法最大的缺陷就是需要使用与水不相混溶的有机溶剂(包括油残留或表面活性剂)，而此类溶剂通常毒性较大，较难从脂质体体系中清除，并且降解活性成分，因此可能导致脂质体有毒， 从而对人体健康产生潜在风险。

流速是脂质体制备中一个非常关键的影响因素，交叉鱼骨形微混合器的微流控芯片结构，并研究了混合器结构不同( 即混合单元数不同)、FR 不同以及醇水溶液汇合处与混合器之间距离不同对制备的脂质体的影响。研究发现混合器混合单元数目和FR大小是制备纳米脂质体的关键因素，FR由小逐渐增加至中等数值时，混合器对纳米脂质体粒径大小的影响比较明显。同时第一个混合单元的位置对于制备纳米脂质体也存在一定的影响。他们推测要形成小粒径纳米脂质体的本质是快速降低乙醇浓度至其临界浓度。利用交叉人字形微混合器结构可以高通量制备由促融脂二油酰基磷脂酰乙醇胺( DOPE) 和阳离子脂(2，3-二油氧基丙基) 三甲基氯化铵( DOTAP ) 组成的单分散阳离子纳米脂质体。制备的阳离子脂质体不仅转染效率高、重复性好，粒径尺寸和分散性则可以通过调节总流速及FR得到很好地控制。